Момордика индийский гранат: Момордика (индийский гранат) — Слушая Ветер — LiveJournal

Комплектующие

Яркий бородавчатый огурец может отпугнуть необычным видом, но на самом деле это очень питательный продукт.В этом овоще много масел, аминокислот, фенолов, гликозидов, алкалоидов, смол. Таким образом, даже семена момордики обладают антисептическим и противовоспалительным действием, а также снимают отечность.

Лечебные свойства растения связаны с богатым набором витаминов. Итак, фолиевая кислота регенерирует клеточную структуру, а никотиновая кислота отвечает за окислительно-восстановительные процессы. Витамины группы В улучшают состояние волос, кожи, тканей. Благодаря бета-каротину разрушаются свободные радикалы, т.е.е. идет борьба с раком. Продукт также содержит пантотеновую кислоту, которая ускоряет выработку клеточной энергии.

Более редкие биологически активные вещества также расширяют лечебные возможности плодов момордики. Витамин Е предотвращает преждевременное старение и обладает антиоксидантным действием, а витамин F тонизирует весь организм и наполняет его силой. Самый распространенный ингредиент, аскорбиновая кислота, также содержится в этих овощах, поэтому иммунитет укрепляется с каждым укусом момордики.

Плоды тыквы, как и молодые побеги, содержат калий, селен, цинк и кремний, которые регулируют многие системы органов. Однако листья также содержат полезные вещества. Это железо, фосфор, натрий и кальций. Без таких минералов обменные процессы в организме протекают неправильно, и при дефиците микро- и макроэлементов состояние человека заметно ухудшается. Вот почему Momordica так важна.

Растение очень полезно для диабетиков.В его плодах есть чарантин — вещество, не только понижающее уровень сахара в крови. Этот компонент нормализует выработку инсулина в организме и увеличивает количество бета-клеток в поджелудочной железе.

Самый мощный антиоксидант, ликопин, также содержится в фруктах Momordica. Индийский огурец подавляет раковые клетки, останавливая рост опухолей в печени и простате. Продукт снижает вероятность возникновения саркомы и меланомы, а также эффективен в борьбе с лейкемией.

Momordica содержит тритерпеновые сапонины в своей корневой системе и поэтому используется для лечения ревматизма. Фрукт — отличный источник фитонцидов, убивающих инфекции и снимающих воспаление.

Использование тыквы для похудения связано с тем, что около 85% в составе всех фруктов составляет вода. Поэтому калорийность продукта очень низкая. Листья, стебли, корни и семена также можно есть, они богаты флавоноидами и органическими кислотами.

Использование

Историческая родина бешеной дыни — Юго-Восточная Азия и некоторые территории Индии. Считается, что об этом продукте знали племена майя, но европейцы познакомились с растением только в 16 веке. Момордика не считается классической тыквенной культурой, так как у нее тонкие и длинные стебли, а также большие бледно-зеленые листья. Во время цветения растение источает чудесный аромат жасмина.

Водянистые и хрустящие фрукты Momordica по вкусу напоминают огурцы и сладкий перец.Коричневые семена овоща придают ему легкую горечь. Но это не мешает использовать продукт даже в составе многих национальных блюд народов Азии и Африки.

Молодые побеги нашли свое применение в современной кулинарии в составе салатов, супов и закусок. Плоды едят сырыми и даже недозрелыми, так как это не влияет на их пользу. Правда, в процессе созревания овощи становятся более терпкими и пряными. Однако полностью спелый продукт имеет сладковатый привкус, поэтому употребляется в свежем виде.В этом случае необходима термообработка для размягчения жестких волокон. Нежные свежие листья момордики можно положить в борщ и винегрет.

Мясистые крупные плоды обычно жарят на растительном масле. Но они одинаково хорошо тушеные, соленые, маринованные, вареные. Момордика также входит в состав легендарной приправы карри. На основе овоща можно приготовить разные напитки: вино, ликер, ликер, тоник. Даже варенье из желтых огурцов вкусное. Чтобы в растении не было горечи, его плоды можно заранее замочить в подсоленной воде.

После созревания внутри любого фрукта Momordica образуются рубиновые ягоды, которые очень сладкие и по вкусу напоминают тропический ананас с ореховыми нотками. Ягоды обычно используют для украшения тортов и различной кондитерской выпечки.

В Азии момордика добавляют в различные овощные рагу. Он сочетается с картофелем, кокосами и даже йогуртом. Племена амазонок кладут листья и фрукты в блюда из бобовых, чтобы придать еде вкус и аромат. Даже в Японии этот овощ очень популярен и считается одной из причин долголетия людей.

Эффективность

Есть сведения, что в Древнем Китае есть момордику, разрешалось только императору и членам его семьи. В Индии считалось растением богов, в Японии — растением долгожителей. В нашей стране этот экзотический огурец можно попробовать в корейских магазинах. Хотя наши садоводы считают, что выращивать момордику самостоятельно намного интереснее и полезнее.

• Индийский гранат стимулирует иммунную систему. Помогает выводить шлаки и шлаки.
• Ягоды повышают остроту зрения, положительно влияют на общее состояние глаз.

Также известны следующие свойства Momordica: спазмолитические, противовоспалительные, противорвотные, вяжущие, успокаивающие свойства. Это растение признано официальной медициной и используется в производстве препаратов, стабилизирующих функции поджелудочной железы.
Ягоды, в отличие от горькой мякоти, сладкие, содержат жирное масло, богатое каротином. Повышает уровень гемоглобина в крови и укрепляет иммунную систему человека.Также ягоды используют для лечения язвенной болезни и гастрита: 1 семя за полчаса до еды разжевывают и засыпают 1 чайной ложкой меда. Делать это нужно 3 раза в день, курс приема — 9 дней. В семенах содержится 32% эфирного лекарственного масла Момордицин, богатого целебным каротином.

Считается, что все части растения питательны и целебны — корни, листья, семена, цветы и плоды. Свежие молодые побеги и листья момордики идут в салаты и винегреты, из которых готовятся вкуснейшие борщи и целебные супы.«Momordica уничтожает раковые клетки, бактерии и вирусы, лечит гипертонию, геморрой, язву желудка, диабет и даже лейкоз. Повышает иммунитет, снимает боль. Быстро выводит лишний жир, ускоряет обмен веществ, делает фигуру стройной. Снижает уровень холестерина в крови, очищает сосуды. Кажется, чудо-огурец подвержен всем недугам, включая ревматоидный артрит, головные и суставные боли, ожоги, псориаз, депрессию, фурункулез, гепатит, простатит, мочекаменную болезнь, склероз.Момордика также лечит глазные болезни, улучшает остроту зрения. Осталось только проверить!

Ученые показали, что это растение увеличивает общее количество бета-ферментов в поджелудочной железе и благотворно влияет на функцию организма по выработке инсулина. Это означает, что вещества, содержащиеся в индийском гранате, помогают регулировать концентрацию сахара в крови. Еще одно полезное свойство Momordica, которое было обнаружено относительно недавно, — это способность подавлять раковые клетки и опухоли. Были проведены исследования, в ходе которых выяснилось, что препараты, в состав которых входит растительный экстракт, помогают остановить распространение опухолей простаты.Многочисленные исследования продемонстрировали противолейкемическую и противоопухолевую активность компонентов, содержащихся в растении, против саркомы, меланомы, рака печени и лейкемии.

Целебные рецепты с момордикой

От давления, мочегонное средство: 1 столовую ложку семян момордики залить половиной литра воды и кипятить 20 минут на водяной бане. Дать остыть, принимать по четверти стакана 3 раза в день. Этот отвар иногда упоминается в источниках по традиционной медицине как средство от геморроя.Затем из него делают холодные примочки. При простуде, псориазе, ревматизме: свежие плоды момордики нарезают кубиками, помещают в стеклянную банку и заливают 0,5 л водки. Настаивать момордику необходимо 2 недели. После этого настойку принимают до еды по чайной ложке. Укрепляющее средство: плод вместе с косточками переворачиваем через мясорубку, заливаем 1 стаканом меда, плюс добавляем стакан грецких орехов. Настаивать 12 часов, съедать по 1 чайной ложке перед основными приемами пищи. Продукт достаточно горький, поэтому его можно запивать водой.

Момордика обладает высокой питательной ценностью, намного превосходящей перец и баклажаны, популярные среди садоводов. Плоды Momordica содержат много белков, углеводов, сахаров, кальция, фосфора, витаминов («А», «В», «В1», «С» и др.). Витамин «Е» во фруктах защищает организм от преждевременного старения, а витамин «F» придает бодрость и силу.
Плоды момордики особенно богаты фолиевой кислотой, от недостатка которой страдает костный мозг, а также существует риск возникновения раковых опухолей.
Momordica используется как натуральное лекарство для уничтожения раковых клеток, бактерий и вирусов, для лечения гипертонии, геморроя, для повышения иммунитета. Это растение быстро выводит из организма лишний жир, ускоряет обмен веществ и делает фигуру стройной.

Для лечения момордики врачи советуют использовать абсолютно все целебные части растения — корни, листья, семена, цветы и плоды.
Momordica особенно широко используется в традиционной тибетско-китайской медицине. Momordica используется как болеутоляющее, для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, рака, язвы желудка, для снижения уровня сахара в крови, для выработки инсулина и лечения диабета.
Momordica ценна для организма, поскольку способствует замедлению процессов старения и достижению активного долголетия.

Плоды и семена Momordica снижают уровень холестерина в крови, предотвращают образование холестериновых бляшек, очищают кровеносные сосуды, снижают вероятность сердечных приступов и инсультов, лечат лейкемию, ревматоидный артрит, боли в голове и суставах, ожоги, псориаз, депрессию, фурункулез, гепатит.
Momordica также лечит глазные болезни, улучшает остроту зрения.
Отвары и настойки Momordica излечивают от простатита, мочекаменной болезни, склероза, улучшают работу мозга и укрепляют иммунную систему.

В последнее время исследователи всерьез заинтересовались его лечебными свойствами, и, прежде всего, способностью влиять на функции поджелудочной железы. Как оказалось, плод Momordica усиливает секреторную активность поджелудочной железы и увеличивает выработку инсулина. Клинические испытания показали, что введение Momordica в рацион больных сахарным диабетом позволяет значительно снизить дозу синтетических аналогов инсулина.

Способность препаратов Momordica подавлять развитие раковых клеток — еще один стимул для экспериментаторов.Противораковая активность Momordica неоднократно подтверждалась результатами различных исследований. Установлено, что процесс метастазирования рака простаты можно остановить с помощью экстрактов Momordica, которые также активны против лейкемии, саркомы и меланомы. Целители Востока издавна использовали Момордику для лечения рака печени и гепатита и прописывали его лекарства во многих случаях тяжелых инфекционных заболеваний. Помимо детоксикации организма (выведения токсинов) момордика действует как иммуномодулятор, мягко стимулируя иммунную защиту, что позволяет эффективно бороться со многими заболеваниями.

Фруктовая настойка Momordica

Семена без семян нарезать небольшими кусочками. Плотно наполните ими трехлитровую банку. В банку налить водку (0,5 л), закрыть крышкой. Инкубируйте две недели в темном прохладном месте.
Настойку плодов Момордики пьют три дня натощак (за 30 минут до еды) по 1 чайной ложке 3 раза в день.
Фруктовая настойка Momordica эффективна при простуде (кашель, насморк, лихорадка), псориазе и ревматизме. А также его используют как средство для укрепления иммунитета организма.

Отвар семян момордики

Около 15-20 измельченных семян момордики заливают 1 стаканом кипятка, выдерживают на слабом огне 10 минут. Затем настаивают час и процеживают.
Настойку семян Momordica пьют по 50 мг 3–4 раза в день при геморрое и как мочегонное средство при лихорадочных заболеваниях.

• Препарат, изготовленный из пульпы, помогает при инфекционных патологиях кожи. Применяется наружно.
• При острых респираторных инфекциях полезны ингаляции от Momordica.
• Отвары из растения используются для лечения простатита, мочекаменной болезни, склероза.
• Фруктовые настойки рекомендуются для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта.
• Ягоды содержат вещества, снижающие уровень холестерина в крови. Поэтому момордика используется при лечении патологий сердца и сосудов.
• Отвар из листьев эффективен как профилактическое средство при эпидемии гриппа.
• Он также обладает обезболивающим действием, что успешно используется при обострении артрита.
• Свежие ягоды уменьшают зуд, предотвращают отеки при укусах насекомых.
• Отвар Momordica помогает при потнице и высыпаниях на коже.
• Если человек получил ожог бензином, нужно наложить горячий компресс из меда и листьев. Рана быстрее заживет, не заразится и не оставит шрамов.

Момордика в медицине широко и многогранна. Его огромная целебная сила и полезные свойства уже давно используются в индийской, китайской и тибетской медицине.В Индии момордики спасли от смерти укусы змей. В рукописи, найденной в тибетском монастыре, говорится, что Момордика вылечил более тысячи болезней. Для лечения используются все части растения: корни, листья, семена, цветы и плоды. Он особенно широко используется в тибетско-китайской медицине для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, язвы желудка, снижения уровня сахара в крови, выработки инсулина и лечения диабета, замедления старения и продления активного долголетия. В наши дни Momordica широко используется как лекарство от раковых клеток, бактерий, вирусов, снижения артериального давления, лечения гипертонии, геморроя, повышения иммунитета, как болеутоляющее.

В момордике обнаружено много уникальных целебных веществ, которых нет в других лекарственных растениях. Культура признана официальной медициной, из нее делают множество препаратов — Momordica compositum, Hepel, Gepar chelidonium, Gomaccord и др. Применение Momordica способствует похуданию, быстро выводит излишки жира с тела, делает фигуру стройной, привлекательной. и красивый. Фрукты и семена снижают уровень холестерина в крови, предотвращают образование холестериновых бляшек, очищают кровеносные сосуды и снижают вероятность сердечных приступов и инсультов.

Momordica лечит лейкоз, ревматический артрит, боли в голове и суставах, ожоги, псориаз, депрессию, фурункулез, печень с гепатитом. Также лечит глазные болезни, улучшает остроту зрения. Высвобождает чарантаин — смесь стероидов, регулирующих уровень сахара в крови, уничтожает устойчивые вирусы герпеса и гриппа, снимает лихорадку, отек и воспаление.

Отвары, настойки и экстракты намного эффективнее других препаратов, они повышают потенцию, излечивают простатит, мочекаменную болезнь, склероз, улучшают работу мозга.Фрукты лечат ожирение, алкоголизм и табакокурение. Момордика широко применяется в косметологии. Настой из его листьев разглаживает морщинки, улучшает состояние кожи, делая ее молодой, эластичной и бархатистой.

Современная наука установила, что вещества, содержащиеся в плодах этого растения, способны снижать общий уровень холестерина, уровень сахара в крови диабетиков, стимулировать выработку инсулина и даже лечить некоторые виды рака. Препараты Momordica используются для лечения псориаза, гриппа и простуды.Многочисленные эксперименты показали, что экстракты его листьев и плодов способны уничтожать стафилококки, стрептококки и даже ВИЧ.

Плоды и семена момордики в рецептах народной медицины используются следующим образом: фруктовая настойка. Плоды момордики необходимо мелко нарезать, переложить в стеклянную емкость, залить 0,5 л водки, накрыть крышкой и дать настояться 2 недели. в прохладном темном месте. После приготовления момордики настойку пьют натощак за 30 минут до еды по 1 чайной ложке три р / день в течение трех дней.Считается, что такой настой эффективен при простуде, лихорадке, насморке, кашле, ревматизме, псориазе, а также применяется для общего укрепления организма, но эти свойства растения не подтверждены официальной медициной. Отвар из семян. Для его приготовления семена момордики (15-20гр) заливают кипятком (250мл), кипятят 10 минут, затем настаивают один час и процеживают. Отвар принимают по 50 мл 3-4 р / день при лихорадке как мочегонное средство или при геморрое.Листья момордики не используются в рецептах народной медицины. Считается, что они слишком токсичны, чтобы причинить вред.

• Отвар семян. Препарат применяют как жаропонижающее и мочегонное средство. Отвар также находит применение при лечении геморроя. На 1 стакан воды — 5-20 г измельченных на кофемолке семян Momordica. Варить при слабом кипении 10 минут, затем настаивать 1 час. Принимать препарат до 4 раз в сутки по 50 мл.
• Порошок семян. Семена момордики перемалывают в кофемолке.Назначают в дозировке 3 — 5 г на прием. Частота приема и показания такие же, как и при использовании отвара.
• Настойка фруктов. Для приготовления лечебной настойки используют недозревшие плоды, которые измельчают, помещают в стеклянную тару (до половины объема) и заливают спиртом крепостью 40% (водкой). Настой проводят в течение 14 дней. Препарат назначают трижды в день по 1 ч. Л., За полчаса до еды. Принимать настойку необходимо курсами по 3 дня.

Вред

Однако какими бы полезными свойствами ни обладало растение, не стоит перебарщивать с его расходом. Если есть желание ощутить чудодейственное действие его плодов, не нужно стараться съесть их как можно больше за один раз, болезнь не вылечишь, да и аллергию заработать вполне можно. К тому же есть очень строгое противопоказание к применению Момордика, это беременность, при употреблении экстракта и плодов этого растения повышается риск самопроизвольного выкидыша.Индивидуальная непереносимость продукта также является одним из противопоказаний. Поэтому, прежде чем пробовать тот или иной незнакомый фрукт или овощ, стоит узнать о нем как можно больше, даже самое полезное растение имеет свои определенные достоинства и недостатки, на которые стоит обратить внимание.

Внимание! Момордика противопоказана беременным, так как обладает абортивными свойствами.

Лечение Момордикой может вызвать повышенное слюноотделение, аллергические реакции. Семена момордики могут вызвать отравление, анемию у детей.Противопоказания к применению момордика Не принимайте момордика беременным и кормящим грудью. Китайская традиционная медицина рекомендует не употреблять растение Momordica при заболеваниях надпочечников, желудка (может спровоцировать изжогу, обострение язвы), а также при запорах. Также лечение Момордикой противопоказано при заболеваниях щитовидной железы.

В Интернете часто можно встретить указания на аллергию при «переедании» плодов Момордики. Справедливости ради стоит отметить, что Momordica — это не клубника, а вкусовые предпочтения европейцев в корне отличаются от предпочтений жителей Востока, поэтому «переедание» практически исключено.При этом индивидуальная непереносимость может вызвать аллергические проявления (зуд, сыпь, боль в горле и др.) — к Momordica нужно привыкать.

Что касается лечения препаратами Момордика, то они не назначаются при беременности, так как есть информация, что некоторые биологически активные вещества, входящие в состав Момордика, обладают абортивными свойствами. Беременным женщинам также нельзя есть момордику. Введение Momordica в рацион при грудном вскармливании может вызвать у грудничка аллергию.

Биологическое действие на организм разных частей растения различно. Так, например, если поедание кожуры благоприятно сказывается на состоянии желудочно-кишечного тракта (имеется в виду при язве желудка и двенадцатиперстной кишки), то препараты на основе листьев могут вызвать обострение заболеваний. Необходимо учитывать все «за» и «против» при наличии таких заболеваний, как гипотиреоз и тиреотоксикоз, при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и надпочечников.

Если переборщить с чахоткой, может возникнуть аллергическая реакция. У некоторых людей аллергия проявляется довольно агрессивно, вплоть до удушья. Будь осторожен!

Momordica токсичен для печени. Ни в коем случае нельзя давать детям кожуру семян.

Таблица значений

Прогуливаясь по рынку или агротехнике, вы наверняка слышали такое название, как «Момордика».Этот экзотический фрукт еще называют индийским огурцом, китайской тыквой или горькой дыней. Так что же это такое? По сути, это род однолетних травянистых растений семейства тыквенных. Произрастает в тропических регионах Африки, Азии и Австралии. Сфера применения касается как кулинарии, так и косметологии и медицины. Более подробно о лечебных свойствах, противопоказаниях и применении мы рассмотрим ниже.

Момордика лечебные свойства и противопоказания

На тему момордики, лечебных свойств и противопоказаний существует великое множество отзывов, так как изначально она использовалась в пищу и затрагивала только узконаправленную область медицины.Настоящие лечебные свойства были обнаружены совсем недавно.

Лечебные свойства

О лечебных свойствах Момордики много отзывов. Если раньше его использовали только в кулинарии и народной медицине, то сейчас он приобрел большую популярность как в фитотерапии, так и в традиционной медицине. Следует знать о следующих лечебных свойствах:
1. Обладает способностью к регенерации клеток. Полезен при заболеваниях центральной нервной системы.
2. При начальной стадии заболеваний желудка и кишечника отвары на основе момордика могут заменить антибиотики.
3. Содержит огромное количество полезных химикатов и минералов. Например: кремний, медь, цинк, витамины C и E. Фолиевая кислота и ниацин.
4. Повышает иммунитет и насыщает организм необходимыми компонентами.

Противопоказания

Во избежание аллергической реакции и нежелательных побочных эффектов следует обратить особое внимание на тему «Момордические противопоказания»:
1. Применение во время беременности категорически запрещено, так как это может спровоцировать преждевременные роды.Момордика также нежелательна при кормлении.
2. Индивидуальная непереносимость. При появлении аллергии или зуда необходимо обратиться к специалисту.
3. В некоторых случаях препараты, не содержащие плодов, могут вызвать обострение заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Виды Momordika

Momordica насчитывает около 20 различных видов, отличающихся друг от друга цветом, запахом и вкусом. Все они обладают особыми свойствами и содержат целебные ингредиенты, поддерживающие организм. Изучая область применения, можно сделать вывод, что это очень многогранный продукт, так как из него можно сделать не только полезный лечебный препарат, но и чудесные блюда.

Вонючий

Вонючий запах Momordica получил свое название от запаха, который он излучает при повреждении или вскрытии плода. Это лианоподобное растение достигает семи и даже восьми метров в длину.

Бальзамический

Momordica Balsamic используется в кулинарии чаще, чем другие разновидности. Во-первых, это самый плодородный вид, способный дать урожай весом 60 кг. и более.
Замечательное полезное масло приготовлено из красной скорлупы «небесного плода».

Кохинхинская

Момордика Кохинхинская (др.Гак) — счастливая обладательница ярко-оранжевого окраса, из-за чего отдаленно напоминает апельсин. В этом случае наибольшую ценность имеют семена, поскольку такого количества каротина в одном продукте нет.

Рецепты момордики — как есть момордика

Есть много способов использовать Момордику. Столь богатое разнообразие рецептов связано с тем, что этот овощ готовят во многих странах мира, а некоторые блюда на его основе являются национальными. Благодаря удивительному вкусовому сходству с грецкими орехами семена часто добавляют в выпечку.Что касается фруктов, то в кулинарии используются только незрелые плоды. Это связано с горечью, присутствующей в зрелых образцах.

Применение в народной медицине

Это очень замечательное растение, потому что в качестве лекарства можно использовать все его части, а именно: листья, корни, семена, плоды и цветы. Особенно эффективен для тела в сушеном виде. Прекрасно помогает зимой при авитаминозах, так как обладает кладезем лечебных свойств.

Настой Momordica для похудения

Настой от Momordika не только усиливает защитные функции организма, но и ускоряет обмен веществ.Если пить настой ежедневно утром и вечером натощак, результат будет заметен очень скоро, ведь он поможет убрать лишний жир. Рецепт: 20 г семян залить 250 мл. горячая вода. Варить на слабом огне 10-15 минут. Емкость с полученными отварами для настаивания поставить в темное сухое место на 2-3 часа. Затем процедите.

При сахарном диабете

Благодаря карантину, которого много в мякоти плода, момордика довольно часто применяется при сахарном диабете.Дело в том, что это вещество снижает уровень сахара и стабилизирует поджелудочную железу, которая в свою очередь отвечает за выработку инсулина. Из листьев горькой дыни можно приготовить отвар, чай или кофе. Способ приготовления:
1 ч. Л. Измельченное сырье залить одним стаканом горячей воды и настаивать примерно на полчаса. Чай лучше всего пить в чистом виде, без каких-либо добавок.

Momordica во время беременности

Во время беременности вам следует воздержаться от использования любого типа momordica, так как это может вызвать сокращение матки и спровоцировать выкидыш.

Как вырастить momordica

Momordica настолько неприхотлива в выращивании и уходе, что выращивать ее в домашних условиях несложно. Это связано с его термостойкостью и структурой. Внешне напоминающая лиану, горькую дыню можно использовать для украшения заборов, беседок и открытых террас. Ниже будет подробно описано, как его лучше выращивать.

Выращивание

Лечебную лозу обычно высаживают в середине весны. Чтобы проросший стебель был крепким, а урожай — обильным, следует устраивать регулярные подкормки почвы.При его выращивании количество вносимых удобрений рассчитывается в зависимости от размера посадочной емкости и количества земли. Это растение обладает уникальной способностью быстро разрастаться, поэтому лозу нужно периодически пересаживать в более глубокий горшок.

Посадка

Тем, у кого есть опыт выращивания тыкв или кабачков, будет намного проще. Все дело в том, что технологии посадки этих культур практически идентичны. Правда, при посадке Момордики следует учитывать несколько важных нюансов.Для посадки лучше всего выбрать грушу Харантию или Бальзамическую.

Инструкция:

• 1. Перед посадкой семена замочить на полчаса в дезинфицирующем растворе.
• 2. Обернуть салфеткой, смоченной водой с медом, и поставить в теплое место.
• 3. Через сутки возьмите семена и немного поцарапайте скорлупу для более быстрого роста будущих побегов. После завершения процедуры снова убрать в теплое место.
• 4. Дождитесь появления ростков.Обычно это происходит через 2-3 недели.
• 5. Положите проросшие семена в землю. Добавьте перегной и дерн (1: 3).
• 6. По окончании процедуры присыпать сверху песком, водой, накрыть посевы и поставить рядом с теплой батареей.
• 7. Через два дня повторите процедуру полива, откройте посевы и поместите их на подоконник.

Семена

Относительно крупные семена (длина 10-14 мм, ширина 9-10 мм) имеют плоскую форму с неровными краями и шероховатой поверхностью.Обе стороны семени покрыты необычным рисунком. Самое интересное, что узор всегда разный по структуре, а по стилю напоминает индийский орнамент.
В качестве сырья для посева нужно выбирать темные семена, так как светлые еще полностью не созрели, из-за чего всходы могут не дать всходов.

Momordica compositum инструкция по применению

Гемеопатический препарат на основе лекарственных растений. Отличное спазмолитическое и обезболивающее.

Показания:

1. Острый панкреатит;
2. Хронический панкреатит;
3. Диспанкреатизм;
4. Другие болезни поджелудочной железы.

Противопоказания:

• Аллергия;
• Во время беременности;
• Гипертиреоз (заболевание щитовидной железы).

Если вы хорошо знакомы с противопоказаниями, вам следует ознакомиться с инструкцией по применению Momordica compositum:

Раствор Композитум вводится внутримышечно, подкожно, внутривенно и внутрикожно.Курс лечения длится от 3 до 5 недель. Взрослым назначают по 1 ампуле 2-3 раза в неделю, а детям от 2 до 7 лет по ½ ампулы 1-3 раза в неделю. Если ребенку меньше двух лет, назначают ампулы.

(бешеный огурец, индийский гранат, горькая тыква, бальзамная груша) — очень красивое растение из тропиков. Ярко-желтые цветы на длинных цветоножках с приятным ароматом эффектно смотрятся на фоне резных светло-зеленых листьев. Также растение очень декоративно в период созревания плодов, которые приобретают оранжево-желтый цвет.Все органы растения в период роста обжигаются при прикосновении, как крапива. Однако при появлении первых спелых плодов момордика перестает кусаться.

Этот род однолетних вьющихся травянистых растений семейства тыквенных культивируется во многих странах, в основном в Азии. Обладает ценными лечебными свойствами и имеет съедобные плоды.

Плоды округло-удлиненные, покрытые мясистыми мелкими шипами. Созревшие плоды желтеют, а затем приобретают ярко-оранжевый цвет.Созревшие плоды растрескиваются с помощью трех створок, на которых расположены крупные плоские семена, помещенные в красную коробочку. Плод приятный на вкус, напоминает спелую хурму.

Лечебные свойства

Плоды Momordica содержат витамины A, B, C, E, F, микроэлементы, белки, углеводы и много фолиевой кислоты.

Биологически активные вещества, содержащиеся в фруктах и ​​семенах, снижают уровень общего холестерина и стимулируют выработку инсулина. Momordica — одно из немногих растений, содержащих харантин, вещество, снижающее уровень сахара в крови.

Применяется при сердечно-сосудистых заболеваниях, сахарном диабете, заболеваниях печени, язве желудка, мочекаменной болезни, для укрепления иммунной системы, при простуде и гриппе, головных болях и болях в суставах, ожогах, псориазе и некоторых видах рака.
Momordica улучшает остроту зрения и лечит глазные болезни.

Особенности выращивания

Momordica имеет очень длительный период созревания, поэтому рекомендуется выращивать ее через рассаду, чтобы сократить вегетационный период в открытом грунте.

Момордика выращивают как огурцы. Семена в начале марта высевают в горшки объемом 0,5 л для получения рассады, после чего высаживают в открытый грунт.

Оболочка семян богата крахмалом и каротиноидами и служит питательным веществом для их роста и развития. Семена высевают по краю на глубину 1-1,5 см в теплый влажный грунт (температура 22-24 ° С). В этих условиях всходы появляются через неделю.
Регулярно опрыскивают теплой водой.

При появлении двух настоящих листочков саженцы высаживают в открытый грунт, стараясь не повредить корневую систему (вместе с комком земли), иначе растения надолго заболеют или могут полностью погибнуть.

Как и все тыквы, сбор недопустим.

Растение достаточно теплолюбивое, поэтому рассаду высаживают, когда миновала угроза заморозков, в хорошо отапливаемых помещениях.

Отбирают самые крупные растения и размещают через каждые 35-50 см с междурядьем 50 см. Можно выращивать без обвязки, как огурцы, или поставить на беседку, забор.
Хорошая освещенность растения при вертикальном выращивании способствует получению максимального урожая.

Momordica также выращивают без косточек.Семена замачивают в воде на 24 часа, затем кладут во влажную ткань (опилки) и держат во влажном состоянии. Через 3-4 дня появляются небольшие корни и семена высаживаются в открытый грунт. Делают это в мае, когда миновала угроза возвратных заморозков. Такие растения дают дружные всходы и быстро развиваются.

Момордика хорошо растет на любых почвах с добавлением перегноя. Не переносит чрезмерного увлажнения. Подкармливают в период вегетации каждые 2 недели минеральными или органическими удобрениями.

Образует большое количество пасынков, утолщающих куст.Чаще всего на растении оставляют 3 основных побега, удаляя всех лишних пасынков. При формировании надевают варежки, чтобы не травмировать руки. Именно из-за этого растение практически не формируется, позволяя ему развиваться самостоятельно.

Пасынки могут быть использованы для разведения. Для этого снизу пасынков срезают черенки с двумя хорошо развитыми листочками и кладут их в теплую воду (не менее 25 ° С). Через 12-14 дней появляются первые корни, а через месяц черенки можно сажать на постоянное место.После посадки растения хорошо поливают и притеняют 2-3 дня.

В отличие от других тыквенных семечек момордика по размеру близка к огурцу. Плоды небольшие, стебель не прогибается под их весом, выдерживая большое их количество.

И еще одна особенность. Свежие плоды горькие, поэтому перед употреблением их замачивают в подсоленной воде на 10-12 часов, после чего пробуют. Если горечь ощущается как горькие огурцы, продолжают замачивание в пресной подсоленной воде.Затем срезают тонкую кожуру с шипами и используют ее для приготовления салатов.

Момордика тушат, солят или маринуют, как огурцы.
Для консервации плод моют, разрезают на части, удаляют семена и снимают кожуру.
Плоды помещают в стерилизованные банки и добавляют чеснок, укроп, листья черной смородины и душистый перец. Влить кипящий маринад и закатать.
Маринад: на 1 литр воды по 1 столовой ложке. соль, сахар, уксус.

Его клубни, листья и молодые побеги также съедобны, они используются в свежем виде в салатах или для приготовления овощных супов.

Узлы памяти

• Созревший плод трескается и выбрасывает семена на несколько метров вместе со слизью. За это растение прозвали «бешеный огурец».
• Семена не всегда есть в наличии, чаще их получают из ярко-оранжевых плодов. Их достаточно промыть и просушить, а весной посеять в горшочки.
• Едят 10-дневные зеленые плоды, так как более зрелые содержат много горечи.
• При недостатке света и питания образуются мелкие плоды, часто опадают завязи.
• С помощью этого растения можно создать живописный забор или стену. Стебель Momordica с помощью усиков оплетает любую решетку, длина его достигает 5 м. Ажурные листья Momordica имеют разные оттенки.

Индийский гранат — представитель семейства тыквенных. У вида более 200 однолетних и многолетних растений, но чаще всего на приусадебных участках можно встретить только одно из них.

Индийский гранат имеет разные названия: крокодиловый огурец, бешеная дыня, бальзамическая груша, желтый огурец, китайский гранат

Официально это растение называется момордика, его родиной является Индия или страны Восточной Азии.Его еще называют крокодиловым огурцом, бешеной дыней, бальзамической грушей, желтым огурцом, китайским гранатом.

Описание завода

1. Однолетняя плетистая травянистая лиана с длинными тонкими стеблями до 2-3 м длиной.
2. Маленькие светло-зеленые листочки. Они имеют пятипалую форму с ярко выраженными зазубринами.
3. Ярко-желтые цветы удлиненной формы. Запах во время цветения напоминает запах жасмина.
4. Побеги и листья в период вегетации имеют тенденцию к ожогам слизистых оболочек и кожи.Место прикосновения краснеет и покрывается небольшой водянкой, как после крапивы. Как только на лиане появляются первые спелые плоды, она перестает вызывать жжение.
5. Плоды имеют цилиндрическую форму с заостренными концами. В период роста они светло-зеленые, а после созревания приобретают желтую окраску.
6. Вся поверхность плода момордики покрыта выпуклыми шершавыми шипами, напоминающими бородавки. Размеры могут варьироваться от 7 до 20 см.
7. После созревания плод трескается, образуя три створки. Внутри большие семена, покрытые сочной красной оболочкой.
8. Красный околоплодник по вкусу напоминает хурму, а мякоть спелой тыквы. Скорлупа плода имеет легкую горечь.

Преимущества

В Индии едят обе части граната. И семена, и мякоть обладают полезными свойствами. Молодые побеги богаты витамином Е и тоже употребляются в пищу. Их добавляют как зелень в свежие салаты.Из них можно приготовить зеленый борщ и овощные супы.

Индийский гранат обладает уникальными лечебными свойствами, с которыми можно бороться:

• развитие как доброкачественных, так и злокачественных опухолей;
• нарушений обмена веществ;
• сахарный диабет;
• гастриты и язвы желудка;
• отложений холестерина в сосудах;
• псориаз;
• головных болей;
• проявлений артрита.

Индийский гранат борется с проявлениями артрита.

Употребление свежих плодов индийского граната ускоряет сжигание жира и повышает иммунитет.Рекомендуется есть момордику и людям с нарушениями зрения, а также страдающим мочекаменной болезнью.

Посев семян

Культура выращивается рассадным способом. Высадка происходит в конце марта или начале апреля.

Перед посадкой семена рекомендуется замочить на несколько часов в слабом растворе марганцовки. Не ждите прорастания, ведь в воде ростки могут загнить. Посадочный материал размещается в отдельных горшках по несколько штук.Глубина заделки не должна превышать 3-5 см.

Почва должна быть умеренно рыхлой. Для этого можно использовать следующую смесь:

• торф;
• листопадный перегной;
• плодородный слой почвы;
• песок.

Почва хорошо увлажнена и горшок ставится в теплое место. Первые всходы появятся через 10-14 дней.

Посадка в открытый грунт

В конце мая рассаду высотой 20–25 см высаживают на открытые грядки.К этому времени угроза возвратных заморозков миновала и растению ничего не угрожает. При пересадке нужно вынуть саженец из горшка, чтобы не потревожить земляной ком, ведь это влияет на его дальнейшее развитие.

Поливать индийский гранат необходимо по мере высыхания верхнего слоя почвы.

Полив прекращают во время цветения культуры и возобновляют после увядания цветов. Вода не должна быть очень холодной, чтобы не повредить нежные корни растения.

Момордике, помимо полива, необходимо:

1. Удаление сорняков. Используйте прополку или мульчирование. Перед формированием семян рекомендуется уничтожить сорняки.
2. Удобрение, которое вносят через несколько недель после посадки и в период образования завязей. Используйте химические смеси, травяные настои или перегной.
3. Подставка для длинных ресниц. Чаще всего роль опоры выполняет вертикальная шпалера. Так работает естественная вентиляция, также легче проникать солнечным лучам к созревающим фруктам.
4. Опыление, поэтому момордику предпочтительно высаживать в открытом грунте, где насекомые-опылители могут добраться до растения.

Индийские блюда из граната

Чаще всего момордику едят в свежем виде или добавляют в супы или салаты. Также его можно консервировать. По вкусу такая заготовка напоминает маринованные огурцы. Соберите недозрелые овощи и замочите их в подсоленной воде на 3-4 часа, чтобы убрать горечь. После плоды помещают в банки и консервируют как огурцы.

Момордика особенно хороша в жареном виде. Для этого из плодов вынимают семена и разрезают на кусочки. Овощ обжаривают на растительном масле, предварительно обвалив его в панировке или обмакнув в кляр. Подается это блюдо как гарнир к птице и рыбе.

Мелкие спелые плоды фаршированы мясным фаршем, рисом и овощами. После они запекаются в духовке или тушатся в томатном соке на медленном огне.

Характеристика растворимой фосфатазы фосфатидной кислоты в горькой дыне (Momordica charantia)

Abstract

Momordica charantia часто называют горькой дыней, горькой тыквой или горькой тыквой, потому что ее плоды имеют горький вкус.Фрукты широко используются в овощных и лечебных травах. Альфа-элеостеариновая кислота является основной жирной кислотой в семенах, но мало что известно о ее биосинтезе. В качестве первого шага к пониманию биохимического механизма накопления жирных кислот в семенах горькой дыни, это исследование было сосредоточено на растворимой фосфатазе фосфатидовой кислоты (PAP, 3-sn-фосфатидатфосфогидролаза, EC 3.1.3.4), которая гидролизует фосфомоноэфирную связь в фосфатидат с образованием диацилглицерин и P _i .PAP обычно делятся на два подсемейства: Mg ²⁺ -зависимый растворимый PAP и Mg ²⁺ -независимый мембранно-связанный PAP. Мы сообщаем здесь о частичной очистке и характеристике Mg ²⁺ -независимой активности PAP в развивающихся семядолях горькой дыни. Белок PAP был частично очищен последовательным центрифугированием на колонках UNOsphere Q и S от растворимого экстракта. Активность PAP была оптимизирована при pH 6,5 и 53–60 ° C и не подвергалась влиянию вплоть до 0.3 мМ MgCl ₂ . Значения K _m и V _max для диолеоилфосфатидной кислоты составляли 595,4 мкМ и 104,9 мкат / мг белка, соответственно. Активность PAP ингибировалась NaF, Na ₃ VO ₄ , Triton X-100, FeSO ₄ и CuSO ₄ , но стимулировалась MnSO ₄ , ZnSO ₄ и Co (NO ₃ ). ) ₂ . Анализ активности в геле и масс-спектрометрия показали, что активность PAP была очищена с рядом других белков.Это исследование предполагает, что белок PAP, вероятно, связан с другими белками в семенах горькой дыни и что новый класс PAP существует как растворимый и Mg ²⁺ -независимый фермент в растениях.

Образец цитирования: Cao H, Sethumadhavan K, Grimm CC, Ullah AHJ (2014) Характеристика растворимой фосфатазы фосфатазы в горькой дыне ( Momordica charantia ). PLoS ONE 9 (9): e106403. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106403

Редактор: Шрикант Анант, Медицинский факультет Канзасского университета, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 5 июня 2014 г .; Одобрена: 5 августа 2014 г .; Опубликовано: 9 сентября 2014 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные включены в документ.

Финансирование: Эта работа была поддержана Программой 306 исследования качества и использования сельскохозяйственных продуктов Министерства сельского хозяйства США (USDA) через CRIS 6435-41000-102-00D и 6435-41000-102-10N.Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой публикации исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения со стороны Министерства сельского хозяйства США. USDA — поставщик равных возможностей и работодатель. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Momordica charantia часто называют горькой дыней, горькой тыквой или горькой тыквой, потому что ее плоды имеют горький вкус. Это тропическая и субтропическая виноградная лоза семейства Cucurbitaceae , широко выращиваемая в Азии, Африке и Карибском бассейне. Растение представляет собой травянистую усиковую лозу длиной до 5 м. Цветение горькой дыни происходит в июне-июле, а плоды появляются в сентябре-ноябре в Северном полушарии. Плод имеет отчетливую бородавчатую внешность и продолговатую форму.Он полый в поперечном сечении с относительно тонким слоем мякоти, окружающим центральную семенную полость, заполненную крупными плоскими семенами и сердцевиной. Плоды обычно употребляют на стадии зеленого или раннего пожелтения. Мякоть плода хрустящая, водянистая по текстуре и на этих стадиях горькая на вкус. Кожица нежная и съедобная. Семена и сердцевина незрелых плодов кажутся белыми, не очень горькие и могут быть удалены перед приготовлением. Горькая дыня часто используется в китайской кулинарии из-за ее горького вкуса, обычно в жарком, супах и травяных чаях.Он также использовался в качестве горького ингредиента в некоторых сортах китайского и окинавского пива. Семена горькой дыни богаты жирными кислотами и минералами, включая железо, бета-каротин, кальций, калий и многие витамины. Композиции жирных кислот масла горькой дыни включают 37% насыщенных жирных кислот, в основном стеариновую кислоту; 3% мононенасыщенных жирных кислот, преимущественно линолевая, и 60% полиненасыщенных жирных кислот, преимущественно альфа-элеостеариновая кислота (α-ESA, 9 цис , 11 транс , 13 транс октадекатриеновая кислота), что составляет 54% общие жирные кислоты [1].

Горькая дыня издавна использовалась в качестве лекарственного средства в Азии и Африке. Он использовался в качестве стимулятора аппетита, лечения желудочно-кишечных инфекций и для снижения уровня сахара в крови у диабетиков в традиционной китайской медицине. Недавние исследования продемонстрировали потенциальное использование масла горькой дыни с широким спектром пищевых и медицинских применений из-за его противоракового действия [2] — [10], антидиабетической активности [11] — [19], противовоспалительного действия. эффект [20], антиоксидантная активность [21] — [23], противояльцерогенный эффект [24] — [26] и ранозаживляющий эффект [27].Альфа-ЭСК, конъюгированная линоленовая кислота, может быть ключевым биологически активным соединением в масле семян. Альфа-ESA из семян горькой дыни оказывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки [6], индуцирует апоптоз и активирует GADD45, p53 и PPARγ в клетках Caco-2 рака толстой кишки человека [3], блокирует пролиферацию клеток рака груди и вызывает апоптоз посредством механизма, который может быть зависимым от окисления [2], защищает плазму, липопротеины низкой плотности и мембраны эритроцитов от окисления, что может быть эффективным для снижения риска ишемической болезни сердца при сахарном диабете [28], и нерегулирует экспрессию мРНК PPARα, PPARγ и их генов-мишеней в Мыши C57BL / 6J [29].Эти исследования показывают, что α-ESA обладает противораковой, антидиабетической и противовоспалительной активностью, подавляет пролиферацию опухолевых клеток, снижает содержание жира в крови и предотвращает сердечно-сосудистые заболевания.

В настоящее время мало что известно о ферментативном механизме биосинтеза α-ESA в семенах горькой дыни. В общем, ацилтрансферазы, включая диацилглицеринтрансферазы [30], [31], добавляют жирные ацильные группы последовательно к sn-1, sn-2 и sn-3 положениям глицерин-3-фосфата (G3P) с образованием триацилглицерина (TAG).Этот путь обычно называют путем Кеннеди или G3P [32]. Ключевым этапом биосинтеза ТАГ является дефосфорилирование sn-3 положения фосфатидата (PtdOH), катализируемое фосфатазой фосфатидной кислоты (PAP или липинами) с образованием диацилглицерина (DAG) и неорганического фосфата (P _i ) (Рисунок 1) [ 33]. PtdOH синтезируется под действием глицерофосфатацилтрансферазы (GPAT) и ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты (LPAAT). Образование DAG считается предпоследним ключевым этапом пути Кеннеди, потому что это критический метаболит для синтеза TAG, фосфатидилэтаноламина (PtdEtn) и фосфатидилхолина (PtdCho) [33] — [35].

В качестве первого шага к пониманию биохимического механизма накопления жирных кислот в семенах горькой дыни мы сосредоточили наши исследования на PAP (3-sn-фосфатидатфосфогидролазе, EC 3.1.3.4), которая дефосфорилирует фосфатидную кислоту (PA, также называемая PtdOH) до сгенерируйте DAG и P _i . Ферменты семейства PAP в настоящее время классифицируются как растворимые PAP [36] или мембраносвязанные PAP [37]. Основываясь на требовании к активности Mg ²⁺ , фермент также можно разделить на 2 класса: Mg ²⁺ -зависимый и Mg ²⁺ -независимый PAP [38].Обычно растворимый PAP является Mg ²⁺ -зависимым; тогда как мембраносвязанный PAP не зависит от Mg ²⁺ . Недавно мы идентифицировали растворимый PAP в семядолях горькой дыни [39]. Мы сообщаем здесь о частичной очистке и характеристике PAP из развивающихся семядолей горькой дыни как растворимого и Mg ²⁺ -независимого фермента.

Результаты и обсуждение

Субклеточное распределение активности PAP в семядолях горькой дыни

PAP в настоящее время классифицируются как растворимые PAP или мембраносвязанные PAP [36].Дифференциальное центрифугирование использовали для разделения фракций цитозоля и микросомальной мембраны для определения субклеточной локализации активности PAP в Momordica charantia (горькая дыня, горькая тыква или горькая тыква). Экстракт семядолей последовательно центрифугировали при 3000 г , 18000 г и 105000 г . Конечный осадок и супернатант после ультрацентрифугирования обычно рассматриваются как микросомальные мембраны и цитозоль соответственно [40].Активность PAP в осадке 105000 г (осадок P3) составляла только 11% от общей активности PAP (рис. 2). После диализа и центрифугирования супернатанта осадок S3 содержал только 1,8%, тогда как супернатант S3 содержал 87,2% от общей активности (рис. 2). Это субклеточное распределение активности PAP ясно продемонстрировало, что большая часть активности PAP в семенах горькой дыни растворима и локализуется в цитозоле.

Рисунок 2. Субклеточное распределение активности PAP в семядолях горькой дыни.

(A) горькая дыня индийского происхождения использовалась в исследовании. (B) Распределение активности PAP в горьких спелых семядолях. Экстракт семядолей последовательно центрифугировали при 3000 г , 18000 г и 105000 г . Конечный осадок (осадок P3) после ультрацентрифугирования обычно рассматривается как микросомальные мембраны. После диализа и центрифугирования супернатанта г 105000 г получали осадок S3 (загрязненные микросомы) и супернатант S3 (цитозоль).Все три фракции анализировали на активность PAP. Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106403.g002

Очистка PAP

PAP был частично очищен из семядолей горькой дыни с помощью комбинации колонок Q и ​​S. Активность фермента определяли двумя анализами: анализами активности PAP и фосфатазы. При анализе активности PAP разделение растворимого PAP с колонкой Q привело к 3.2-кратная очистка с выходом 90,3% от общей активности PAP (таблица 1). Белок PAP не связывался эффективно с S-колонкой, и 83,3% активности PAP было восстановлено в проточном потоке. Отделение белков от проточного потока второй колонкой Q немного повысило чистоту с 1,2-кратной удельной активностью по сравнению с загрузкой, и было восстановлено от общей активности (Таблица 1). После изменения условий связывания некоторое количество белка PAP было связано с S-колонкой, что привело к лучшей очистке (в 3 раза), но эта стадия снизила выход PAP при элюировании до 20% нагрузки (таблица 1).Эта схема очистки генерировала белки PAP с общим 12,5-кратным коэффициентом очистки и выходом 11,4% с использованием анализа активности PAP (таблица 1). Более высокий коэффициент очистки (16 раз) и более высокий выход (14,5%) очистки PAP были получены из тех же образцов белка при использовании анализа активности фосфатазы (таблица 1). Дальнейшая очистка смолой Affigel Blue не привела к какому-либо улучшению чистоты и фактически снизила общую активность PAP (данные не показаны). Выход и удельная активность PAP из горькой дыни намного выше, чем у PAP, очищенного из Lagenaria siceraria (тыквенная тыква, тыква опо или длинная дыня) [41].Дополнительные стадии очистки привели к значительной потере активности, а выход белка был низким, вероятно, из-за PAP-ассоциированного с другими белками (см. Ниже).

Линейность анализа PAP

При первоначальной характеристике частично очищенного фермента PAP линейность между временем инкубации и активностью PAP наблюдалась в 50 мМ имидазоловом буфере, содержащем 0,3 мМ MgCl ₂ , pH 6,5 (рис. 3A). Подобная линейность ферментативной реакции наблюдалась в ответ на количество ферментов, используемых в анализе (рис. 3B).Подбор данных показал, что коэффициент детерминации (R2) был выше 0,99 в обоих анализах, что свидетельствует о большой корреляции между активностью PAP и временем реакции или количеством используемого фермента. Эти результаты анализа предполагают, что установленные анализы подходят для характеристики частично очищенного PAP из горькой дыни.

Рисунок 3. Линейность анализов PAP.

PAP определяли с использованием аликвот белков из второй фракции S-колонки после очистки PAP.(A) Активность PAP в зависимости от времени реакции. Анализ выполняли при 53 ° C в течение различного времени с 500 мкМ DPA и 0,3 мМ MgCl ₂ . Аликвоты ферментативных реакций отбирали для измерения в указанные моменты времени. (B) Активность PAP в зависимости от количества фермента. Анализ проводили при 53 ° C с использованием различных количеств препарата PAP с 500 мкМ DPA и 0,3 мМ MgCl ₂ . Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0106403.g003

Оптимальные значения pH и температуры для PAP

Оптимумы pH PAP наблюдались при pH 6,5 в условиях анализа с использованием 5 мкл фермента и 500 мкМ диолеоил-фосфатидной кислоты (DPA) в 50 мМ имидазоловом буфере, содержащем 0,3 мМ MgCl ₂ (рис. 4A). Температурный оптимум находился в диапазоне от 53 до 60 ° C (Рисунок 4B). Эти оптимальные значения pH и температуры немного выше, чем у неочищенного экстракта [39]. Из этого исследования не ясно, почему температурный оптимум необычно выше, чем у других метаболических ферментов, таких как растворимые синтазы крахмала из зерен кукурузы [42].

Рисунок 4. Влияние pH буфера и температуры анализа на активность PAP.

Анализ проводили при 53 ° C в течение 30 минут с использованием 5 мкл препарата PAP с 500 мкМ DPA и 0,3 мМ MgCl ₂ . (A) Профиль pH фермента PAP, катализирующего PtdOH. (B) Температурный профиль фермента PAP, катализирующего PtdOH. Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106403.g004

Mg

Исходя из требований к активности Mg ²⁺ , ферменты семейства PAP, включая липины и липидфосфатфосфатазы (LPP), делятся на 2 класса: Mg ²⁺ -зависимый PAP и Mg ²⁺ -независимый PAP [ 38].Известно, что дрожжи и беспозвоночные имеют один ортолог липина, но у растений есть два гена PAP / липина, а у млекопитающих — три гена липина [33]. Члены семейства липинов PAP являются растворимыми ферментами, и для их активности требуется Mg ²⁺ . LPP также проявляют активность PAP, но они структурно не связаны с липиновыми белками. LPP локализованы на плазматической мембране и не требуют Mg ²⁺ для своей активности. Мы определили влияние Mg ²⁺ на активность PAP с использованием очищенного PAP.Наши результаты показали, что на активность PAP не влияет или минимально влияет до 0,3 мМ MgCl ₂ в тестовых смесях (рис. 5). Были измерены эффекты ионных хелатеров EDTA и EGTA на активность PAP. Однако оба хелатора не оказывали значительного влияния на активность PAP (данные не показаны). Этот результат дополнительно подтвердил, что активность растворимого PAP не зависит от Mg ²⁺ в экстракте горькой дыни. Эти результаты анализа подтверждают предыдущие наблюдения неочищенного экстракта горькой дыни и частично очищенного PAP тыквы, что эти PAP являются Mg ²⁺ -независимым ферментом [39], [41].Общие результаты предполагают, что в горькой дыне и бутылочной тыкве существует новый класс PAP, который представляет собой растворимый и независимый от Mg ²⁺ фермент.

Рис. 5. Влияние Mg ²⁺ на активность PAP, катализирующую PtdOH.

Анализ проводили при 53 ° C, pH 6,5 в течение 30 мин с использованием 5 мкл препарата PAP с 500 мкМ DPA и различных концентраций MgCl ₂ . Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0106403.g005

Кинетические параметры PAP

Кинетические параметры PAP определяли с использованием очищенного белка и DPA в качестве субстрата в оптимизированных условиях анализа (pH 6,5, 53 ° C и 0,3 мМ MgCl ₂ ). Фермент давал типичную сигмоидальную кривую для субстрата (рис. 6). Значения K _m и V _max для DPA составляли 595,4 мкМ и 104,9 мкат / мг белка, соответственно. Эти значения K _m и V _max для очищенного PAP из горькой дыни были приблизительно в 4 и 56 раз, соответственно, по сравнению с значениями, полученными из неочищенного экстракта горькой дыни [39].Эти значения K _m и V _max для очищенного PAP из горькой дыни были примерно в 3 раза выше, чем для частично очищенного PAP из бутылочной тыквы [41]. Различия в кинетических параметрах PAP между препаратами частично очищенного PAP и неочищенного PAP согласуются с некоторыми наблюдениями из предыдущих публикаций. Ожидается, что значения V _max очищенных или частично очищенных ферментов намного выше, чем значения неочищенных ферментных препаратов, поскольку значения V _max рассчитаны на основе количества белков, используемых в анализах.Также наблюдается, что значения K _m очищенных ферментов выше, чем значения неочищенного ферментного препарата. Например, ранее мы наблюдали, что значение K _m частично очищенной синтазы крахмала II примерно в 2,5 раза выше, чем у неочищенных экстрактов [42], [43].

Рисунок 6. Кинетицис активности фермента PAP. Активность PAP в зависимости от концентрации субстрата.

Анализ проводили при 53 ° C, pH 6,5 в течение 10 мин с использованием различных концентраций DPA.Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106403.g006

Влияние ингибиторов фосфатаз, добавок и катионов на активность PAP

Три ингибитора фосфатазы были использованы для проверки их влияния на активность PAP. NaF частично ингибировал активность PAP. Ортованадат натрия подавлял активность PAP до 90%. Однако тартрат натрия не влиял на активность PAP в условиях анализа (фигура 7A).Triton X-100 значительно снизил активность PAP, но другие испытанные добавки не повлияли на его активность (рис. 7B). Эффекты катионов в буферах для анализа значительно изменили активность PAP. В частности, MnSO ₄ , ZnSO ₄ и Co (NO ₃ ) ₂ повышали активность PAP, но FeSO ₄ и CuSO ₄ снижали его активность (Рисунок 7C).

Рис. 7. Влияние ингибиторов фосфатазы, добавок и катионов на активность PAP.

Анализы проводили при 53 ° C, pH 6.5 в течение 10 мин, используя 5 мкл препарата PAP с 500 мкМ DPA. (A) Влияние ингибиторов фосфатазы на активность PAP. В качестве ингибиторов фосфатазы использовали NaF (1 мМ), тартрат натрия (4 мМ) и ортованадат натрия (2 мМ). (B) Влияние добавок на активность PAP. Конечная концентрация каждой добавки в буфере для анализа составляла 100 мМ, за исключением того, что TX-100 использовали в концентрации 10%. (C) Влияние катионов на активность PAP. Конечная концентрация каждого катиона в буфере для анализа составляла 0,3 мМ. Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106403.g007

Анализ активности PAP в собственном геле

Очищенные фракции PAP из колонки Affigel Blue содержали ряд совместно очищенных белков на SDS-PAGE (фиг. 8A), но на нативном геле не наблюдалось четких полос белка (фиг. 8C). Активность PAP анализировали с помощью анализа активности фосфатазы в геле. Активность геля показала, что полоса положительного контроля B-фикоэритрина была резкой, но полоса активности PAP отображала широкий диапазон полос мазка с очень большим размером на нативном геле (фигура 8B).Эти результаты предполагают, что белок PAP, вероятно, мультимерлизирован и / или связан с другими белками прямо и / или косвенно, что, вероятно, является одной из причин трудностей в дальнейшей очистке PAP до гомогенности.

Рисунок 8. SDS-PAGE и анализ нативного геля белкового состава и активности PAP.

(A) Денатурирующий гель-анализ очищенных фракций PAP с колонки Affigel Blue с помощью SDS-PAGE и окрашенных нитратом серебра. Дорожки 1 и 11, стандарты белка Bio-Rad Precision plus; переулки 2–4, 0.28, 0,55 и 0,83 мкг фракции №4; дорожки 5–7: 0,19, 0,37 и 0,56 мкг фракции №5; дорожки 8–10, 0,30, 0,60 и 0,90 мкг объединенных фракций 11–17. (B) Активность PAP, определенная с помощью анализа фосфатазы в геле с DiFMUP. Дорожки 1 и 8, B-фикоэритрин положительного контроля; дорожки 2–7, 0,5, 1, 3, 6, 10 и 12 мкг PAP из объединенной фракции. (C) Нативный гель-анализ очищенных фракций PAP, окрашенных кумасси синим. Дорожки 1 и 8 — стандарты неокрашенного белка нативных маркеров; дорожки 2–7, 0,5, 1, 3, 6, 10 и 12 мкг PAP из объединенной фракции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106403.g008

Масс-спектральная идентификация PAP-ассоциированных белков

Мы попытались идентифицировать PAP-ассоциированные белки в очищенных фракциях с помощью масс-спектрометрии. Фракции PAP из второй колонки Q и колонки Affigel Blue объединяли и концентрировали для расщепления трипсином и эндопротеиназой GluC соответственно. Расщепленные пептиды разделяли с помощью ЖХ и идентифицировали с помощью МС / МС. MS-генерируемые мс-ионы искали по доступным базам данных последовательностей растений в библиотеке неизбыточных белков NCBI.ЖХ / МС / МС идентифицировали 10 и 24 PAP-ассоциированных белка в переваривании трипсина и GluC, соответственно (таблица 2). МС / МС идентифицировали четыре белка в переваривании трипсина и GluC, соответствующих инактивирующему рибосомы белку момордин I, ингибитору эластазы 4, малатдегидрогеназе и ингибитору трипсина 2 (таблица 2). Однако ни одна из ms не соответствовала последовательностям PAP у других видов. Эти результаты MS / MS предполагают, что белок PAP, вероятно, связан с другими белками и что сам PAP является второстепенным компонентом в очищенной фракции.

Выводы

Фосфатазы фосфатидной кислоты (PAP) катализируют дефосфорилирование фосфатидной кислоты до диацилглицерина, предпоследнюю стадию синтеза ТАГ. PAP широко присутствуют в растениях, животных, микробах и людях. PAP обычно делятся на два подсемейства: Mg ²⁺ -зависимый растворимый PAP и Mg ²⁺ -независимый мембранно-связанный PAP. В этом исследовании мы предоставили доказательства существования нового класса фермента PAP в горькой дыне ( Momordica charantia ).Этот класс PAP растворим и не зависит от Mg ²⁺ . Белок PAP, вероятно, связан с другими белками масличных семян. Горькая дыня издавна использовалась в качестве лечебного средства. Молекулярная основа такого использования подтверждается недавними исследованиями, показывающими, что масло горькой дыни может использоваться в широком спектре пищевых и медицинских применений. Следовательно, понимание и регулирование активности PAP может привести к увеличению выхода масла горькой дыни. Выяснение функций PAP может привести к новым подходам к модуляции клеточного накопления липидов и метаболических заболеваний.

Материалы и методы

Растительный материал

Momordica charantia плода (горькая дыня) (индийского происхождения) были куплены в восточном продуктовом магазине в Новом Орлеане, штат Луизиана, США. Плоды были собраны примерно 6 дюймов в длину (средний уровень зрелости), что находится на идеальной стадии развития для потребления человеком. Семена извлекали из семенной полости плодов и промывали 0,9% ледяным физиологическим раствором. Наружные оболочки семян удаляли при комнатной температуре с помощью скальпеля, а семядоли удаляли вручную.

Приготовление тканевого экстракта

Все операции проводились при 4 ° C. Семядоли семян массой 91 г гомогенизировали в 100 мл буфера для экстракции (50 мМ NaOAc, pH 5,0, 150 мМ NaCl и 10 мМ MgCl ₂ ) с использованием политронного тканевого средства (Tekmar Tissumizer MarkII, Цинциннати, ОН) при низких, средних и высоких значениях. скорость по 30 с каждый. Гомогенат охлаждали на льду в течение 1 мин между взрывами. Гомогенат центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут и полученный супернатант (S1) центрифугировали при 18000 g в течение 30 минут при 4 ° C (Sorvall RC2B, Майами, Флорида).Этот супернатант (S2) ультрацентрифугировали при 105000 г в течение 60 минут при 4 ° C (Sorvall Discovery 100SE, Hitachi Ltd, Токио, Япония), и полученный супернатант (S3, цитозоль) и осадок (P3, микросомальные мембраны) обрабатывали. собраны. Супернатант S3 подвергали диализу для удаления Pi из экстракта семян против имидазольного буфера (25 мМ имидазольный буфер, pH 6,5, 1 мМ MgCl ₂ ) с тремя заменами буфера по 500 мл. Диализованный супернатант стал мутным после диализа, который удаляли центрифугированием при 18000 g в течение 30 минут при 4 ° C.Конечный супернатант (S3-супернатант) и осадок (S3-осадок), а также P3 использовали для определения субклеточного распределения активности PAP, а S3-супернатант использовали для очистки PAP. Содержание белка в супернатанте определяли методом бицинхониновой кислоты (BCA) (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Очистка PAP

PAP включал четыре этапа хроматографии, состоящие из повторения колонок UNOsphere Q и S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).Колоночную хроматографию выполняли при температуре окружающей среды 25 ° C с использованием хроматографической рабочей станции BioLogic LP (Bio-Rad Laboratories). Во время различных стадий очистки активные фракции были идентифицированы с помощью анализа PAP. Параллельный анализ фосфатазы с использованием п-нитрофенола также был проведен для подтверждения чистоты, поскольку было обнаружено, что фермент PAP обладает активностью фосфатазы, тогда как не все фосфатазы обладают активностью PAP. Все буферы, использованные на различных стадиях очистки, содержали 1 мМ MgCl ₂ .Вкратце, диализованный S3-супернатант экстракта семядолей горькой дыни наносили на колонку UNOsphere Q объемом 20 мл (2,5 × 4,0 см), уравновешенную 25 мМ имидазольным буфером, pH 6,5, при скорости потока 3,0 мл / мин. Затем колонку промывали тем же буфером с последующей ступенчатой ​​элюцией градиентом NaCl в имидазольном буфере (25 мМ, pH 6,5) в диапазоне от 0,2 до 0,4 М с шагом 0,05 М NaCl, а затем 0,5 и 1,0 М NaCl. Элюированные фракции с активностью PAP объединяли, диализовали против (25 мМ, pH 6.5) и наносили на колонку UNOsphere S объемом 20 мл (2,5 × 4,0 см), уравновешенную тем же буфером, при скорости потока 3,0 мл в минуту. Активность PAP была обнаружена в несвязанных фракциях. Для дальнейшей очистки использовали последовательные колонки UNOsphere Q и S (1 мл). Буфер и условия элюирования были такими же, за исключением того, что колонка S была проведена при pH 4,5 (25 мМ ацетатный буфер). Активность PAP была обнаружена в элюированных фракциях. Конечный белок с активностью PAP концентрировали ультрафильтрацией и использовали для анализа активности ферментов.Концентрированные белки дополнительно очищали на колонке Affigel Blue (Bio-Rad Laboratories) в 25 мМ имидазоле, pH 6,5 и 1 мМ MnSO ₄ . Подавляющее большинство активности PAP не было привязано к колонке. Активные фракции объединяли и концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra-0,5 мл (Millipore Corporation, Billerica, MA) для SDS-PAGE, анализа активности фосфатазы в геле и расщепления протеазой.

Анализ активности PAP

PAP определяли с помощью анализа высвобождения P _i и анализа фосфатазы.Эти анализы активности PAP горькой дыни были описаны ранее [39]. Для анализа высвобождения Pi использовали метод молибдата аммония-ацетон-кислота (AMA) [44]. Для стандартного анализа, если иное не указано ниже, 50 мкл фермента PAP добавляли к 900 мкл 50 мМ имидазольного буфера, pH 6,5, на водяной бане при 53 ° C. Ферментативную реакцию инициировали добавлением 50 мкл PtdOH / DPA (диолеоил-фосфатидная кислота или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфат, натриевая соль, Avanti Polar Lipids, Inc., Алабастер, Алабама), инкубировали в течение 30 мин и останавливали 2 мл реагента AMA.Лимонную кислоту (0,1 мл, 1,0 М) добавляли в каждую пробирку спустя 30 секунд для фиксации цвета с последующим центрифугированием при 13000 g в течение 7 минут (Eppendorf 5415C, Westbury, NY). Оптическую плотность при 355 нм измеряли после блокировки спектрофотометра соответствующим контролем, который был остановлен в нулевое время. Активность PAP выражали в нанокатали на миллилитр (ηкат / мл, ηмоль ортофосфата, высвобождаемого в секунду). Одна международная единица (МЕ) эквивалентна 16,67 нкат.

Для определения оптимума pH PAP горькой дыни мы использовали 25 мМ глицин-HCl (pH 1.5–3,0), 50 мМ ацетата натрия (pH 3,5–5,5) и 25 мМ имидазола (pH 6–9). Для измерения оптимальной температуры образцы инкубировали с субстратом при температуре от 20 до 70 ° C в 25 мМ имидазоле, pH 6,5. Оптимумы Mg ²⁺ определяли с помощью анализа фосфатазы с использованием до 3 мМ MgCl ₂ в тестовых смесях. Общие процедуры для характеристики PAP были аналогичны тем, которые использовались для синтаз растворимого крахмала [42].

Активность фосфатазы

Для анализа фосфатазы фермент PAP (от 2 до 10 мкл) добавляли к объему 950 мкл буфера (50 мМ имидазол, pH 6.5) и инкубировали при 53 ° C в течение 2–5 мин с 1,25 ммоль ρ-нитрофенилфосфата (ρNPP) в конечном объеме 1,0 мл. Реакцию прекращали добавлением 0,1 мл 1,0 н. NaOH и высвободившийся ρ-нитрофенол измеряли спектрофотометрически при 400 нм [45].

Кинетика PAP

K _m и V _max для PAP горькой дыни с использованием анализа высвобождения P _i определяли при 53 ° C и pH 6,5, как указано выше. Концентрация DPA составляла от 0 до 500 мкМ.Программное обеспечение WindowChem Enzyme Kinetics версии 1.1 (Фэрфилд, Калифорния) использовалось для вычисления значений K _m и V _max .

Денатурирующий гель-электрофорез

Очищенный препарат фермента PAP из колонки Affigel Blue анализировали с помощью SDS-PAGE (200 В и 70 мин) с использованием гелей Xcell II, Mini-Cell и 4–12% Novex NuPage Bis-Tris с MOPS в качестве рабочего буфера (Life Technologies, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк). Разделенные белковые полосы визуализировали с помощью набора для окрашивания серебром Pierce с использованием предварительно окрашенных многоцветных маркеров молекулярной массы (от 4 до 250 кДа) в качестве стандартов размера (Thermo Scientific).

Нативный гель-электрофорез и анализ активности фосфатазы в геле

Очищенный препарат фермента PAP также анализировали с использованием нативного геля для анализа активности PAP в геле с использованием гелей Xcell II, Mini-Cell и 3–12% Novex NuPage Bis-Tris с нативным рабочим буфером NuPAGE (Life Technologies). В нативный гель загружали 0,5–12 мкг белков, очищенных на колонке Affigel Blue. Полосы белка на геле визуализировали окрашиванием кумасси синим (Simple Blue SafeStain, Life Technologies), используя стандарты неокрашенного белка с нативной меткой (от 20 до 1236 кДа) в качестве стандартов размера (Thermo Scientific).Активность PAP на неокрашенном нативном геле определяли с использованием 6,8-дифтор-4-метилумбеллиферилфосфата (DiFMUP) в качестве субстрата и B-фикоэритрина в качестве положительного контроля (Life Technologies). Анализ активности проводили путем инкубации нативного геля в 3 мл реакционной смеси, содержащей 0,5 мМ DiFMUP, 50 мМ имидазол, pH 6,5, 3 мМ MnCl ₂ и 100 мМ DTT при 37 ° C в течение 5 минут.

Расщепление очищенного фермента PAP трипсином

Фракцию фермента из колонки Affigel Blue концентрировали в концентраторе Centricon (Amicon, устройства для центробежных фильтров, Millipore Corporation), и в ходе этого процесса имидазольный буфер заменяли на буфер для протеазного расщепления (50 мМ карбонат аммония, pH 8.0). Триптические гидролизаты готовили в соответствии с инструкциями к набору для триптического гидролиза и гуанидинирования в растворе (Thermo Scientific). Вкратце, PAP-содержащие белки (5-10 мкг) добавляли к 15 мкл буфера для переваривания, содержащего 5,6 мМ DTT, в общем объеме 27 мкл в микроцентрифужной пробирке. Перевариваемую смесь инкубировали при 95 ° C в течение 5 минут. Для алкилирования белков к смеси добавляли 3 мкл 100 мМ йодацетамида и хранили при комнатной температуре в темноте. В каждую пробирку добавляли 2 мкл активированного трипсина (100 мкг / мкл) и инкубировали при 37 ° C в течение 3 часов с последующим добавлением 1 мкл трипсина к смеси для переваривания и инкубировали еще 2 часа для лучшего переваривания.Продукты переваривания гуанидилировали для превращения лизина в гомоаргинин путем добавления 10 мкл 30% NH ₄ OH и 6 мкл реагента гуанидирования (50 мг гемисульфата O-метилизомочевины в 51 мкл H ₂ O) и инкубировали при 65 ° C в течение 12 мин. Реакцию останавливали добавлением 3 мкл трифторуксусной кислоты (TFA) и хранили при –20 ° C перед анализом ЖХ / МС / МС.

Расщепление очищенного фермента PAP эндопротеиназой GluC

Фракцию фермента из колонки Affigel Blue концентрировали в концентраторе Centricon (Amicon, центробежные фильтрующие устройства, Millipore Corporation), и в то же время буфер заменяли на буфер для протеазного расщепления (50 мМ карбонат аммония, pH 7.8). Переваривание эндопротеиназы GluC готовили в соответствии с инструкциями производителя (New England Biolabs, Бостон, Массачусетс). Вкратце, PAP-содержащие белки (10–20 мкг) смешивали с 0,5 мкг эндопротеиназы GluC и инкубировали при 37 ° C в течение 16 часов. Реакцию останавливали добавлением 6 мкл TFA и хранили при –20 ° C перед анализом ЖХ / МС / МС.

Разделение пептидов, масс-спектральное секвенирование и поиск в базе данных

Расщепленные протеазы анализировали с помощью ЖХ / МС / МС, состоящего из системы ВЭЖХ Agilent 1200, интерфейса Agilent Chip-cube и тандемного масс-спектрометра Agilent 6520 Q-TOF (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния).Пептиды разделяли с использованием Chip, состоящего из колонки для обогащения 40 нл и аналитической колонки 43 мм, заполненной C ₁₈ (шарики 5 мкм с порами 300 Å). Аликвоту образца объемом 1 мкл переносили в колонку для обогащения с помощью капиллярного насоса, работающего при скорости потока 4 мкл / мин. Нанонасос работал при скорости потока 600 нл / мин. Начальный градиент 97% растворителя A (0,1% муравьиной кислоты в H ₂ O) и 3% растворителя B (90% ацетонитрила / 0,1% муравьиной кислоты в H ₂ O) был изменен на 60% растворитель A при 12 мин, 20% через 13 мин и выдержку до 15 мин.Для уравновешивания колонки использовали дополнительное время 3 мин. Источник МС работал при 300 ° C с потоком 5 л / мин N ₂ и напряжением фрагментатора 175 В. В качестве газа столкновения использовался N ₂ , энергия столкновения которого варьировалась в зависимости от массы и заряда с использованием крутизна 3,7 В / 100 Да и смещение 2,5 В. Как счетверенные, так и времяпролетные (TOF) работали в режиме положительных ионов. Контрольные соединения 322,048121 Да и 1221,9

Да постоянно просачивались в источник для калибровки массы.Первоначальное сканирование MS было выполнено от m / z 300 до 1600, и до трех многозарядных ионов были автоматически выбраны для анализа MS / MS. После первоначального запуска была сделана вторая инъекция, исключая ионы, ранее предназначенные для анализа МС / МС. ЖХ-хроматограммы и масс-спектры исследовали с использованием программного обеспечения Mass-Hunter (версия B.0301; Agilent Technologies). Файлы данных были перенесены на рабочую станцию ​​Agilent, оснащенную программным обеспечением Spectrum Mill (Agilent Technologies). Необработанные файлы данных MS / MS были извлечены, секвенированы и проанализированы в библиотеке неизбыточных белков Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Благодарности

Эта статья посвящена памяти доктора Абул Хаснат Джаффор Улла, который работал в Южном региональном исследовательском центре USDA-ARS в течение 28 лет и инициировал это исследование, но внезапно скончался от сердечного приступа 21 августа 2013 года в возрасте 65. Авторы благодарят д-ра К. Томаса Классона за поддержку и д-ра К. Si-Yin Chung, Thach-Mien D Nguyen и Dunhua Zhang за полезные комментарии к рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AHJU KS HC.Проведены эксперименты: KS CCG. Проанализированы данные: ХК КС. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: HC CCG. Участвовал в написании рукописи: HC.

Ссылки

1. 1. Лю XR, Deng ZY, Fan YW, Li J, Liu ZH (2010) Анализ минеральных элементов семян Momordica charantiap с помощью ICP-AES и определение профиля жирных кислот масла семян с помощью GC-MS. Гуан Пу Сюэ Ю Гуан Пу Фэнь Си 30: 2265–2268.
2. 2. Гроссманн М.Э., Мизуно Н.К., Даммен М.Л., Шустер Т., Рэй А. и др.(2009) Элеостеариновая кислота подавляет пролиферацию рака груди посредством механизма, зависимого от окисления. Cancer Prev Res (Phila) 2: 879–886.
3. 3. Ясуи Ю., Хосокава М., Сахара Т., Сузуки Р., Охия С. и др. (2005) Жирная кислота семян горькой тыквы, богатая конъюгированной 9c, 11t, 13t линоленовой кислотой, индуцирует апоптоз и активирует GADD45, p53 и PPARgamma в клетках Caco-2 рака толстой кишки человека. Простагландины Leukot Essent Fatty Acids 73: 113–119.
4. 4. Коно Х., Сузуки Р., Ясуи Й., Хосокава М., Мияшита К. и др.(2004) Масло косточек граната, богатое конъюгированной линоленовой кислотой, подавляет химически индуцированный канцерогенез толстой кишки у крыс. Cancer Sci 95: 481–486.
5. 5. Коно Х., Ясуи Ю., Сузуки Р., Хосокава М., Мияшита К. и др. (2004) Масло из диетических семян, богатое конъюгированной линоленовой кислотой из горькой дыни, ингибирует индуцированный азоксиметаном канцерогенез толстой кишки крыс за счет повышения экспрессии PPARgamma в толстой кишке и изменения липидного состава. Int J Cancer 110: 896–901.
6. 6. Судзуки Р., Ногучи Р., Ота Т., Абэ М., Мияшита К. и др.(2001) Цитотоксический эффект конъюгированных триеновых жирных кислот на опухоли мышей и клетки моноцитарного лейкоза человека. Липиды 36: 477–482.
7. 7. Кватра Д., Субраманиам Д., Рамамурти П., Стэндинг Д., Моран Е. и др. (2013) Метанольные экстракты горькой дыни подавляют стволовые клетки рака толстой кишки, влияя на энергетический гомеостаз и аутофагию. Evid Based Complement Alternat Med 2013: 702869.
8. 8. Раджамурти А., Шривастава С., Стил Р., Неруркар П., Гонсалес Дж. Г. и др. (2013) Горькая дыня снижает рост плоскоклеточного рака головы и шеи, воздействуя на передачу сигналов c-Met.PLoS ONE 8: e78006.
9. 9. Zeng YW, Yang JZ, Pu XY, Du J, Yang T и др. (2013) Стратегии функционального питания для профилактики рака у людей. Азиатский Pac J Cancer Prev 14: 1585–1592.
10. 10. Brennan VC, Wang CM, Yang WH (2012) Экстракт горькой дыни (Momordica charantia) подавляет пролиферацию адренокортикальных раковых клеток за счет модуляции пути апоптоза, стероидогенеза и рецептора инсулиноподобного фактора роста типа 1 / RAC-альфа-серина / RAC-альфа-трена / белка-треска RAC-альфа передача сигналов киназой.J Med Food 15: 325–334.
11. 11. Ахмад З., Замхури К.Ф., Яакоб А., Сионг С.Х., Сельвараджа М. и др. (2012) Антидиабетическая активность in vitro и химический анализ полипептида-k и масла, выделенного из семян Momordica charantia (горькая тыква). Молекулы 17: 9631–9640.
12. 12. Дхар П., Чаттопадхьяй К., Бхаттачарья Д., Ройчоудхури А., Бисвас А. и др. (2006) Антиоксидантный эффект конъюгированной линоленовой кислоты в крови диабетиков и недиабетиков: исследование in vitro.J Oleo Sci 56: 19–24.
13. 13. Оиси Ю., Сакамото Т., Удагава Х., Танигучи Х., Кобаяси-Хаттори К. и др. (2007) Ингибирование увеличения содержания глюкозы в крови и нейтрального жира в сыворотке за счет сапониновой фракции Momordica charantia. Biosci Biotechnol Biochem 71: 735–740.
14. 14. Saha SS, Ghosh M (2012) Антиоксидантный и противовоспалительный эффект конъюгированных изомеров линоленовой кислоты против диабета, индуцированного стрептозотоцином. Br J Nutr 108: 974–983.
15. 15. Эфирд Дж. Т., Чой Ю. М., Дэвис С. В., Мехра С., Андерсон Э. Дж. И др.(2014) Возможность улучшения гликемического контроля с помощью диетического Momordica charantia у пациентов с инсулинорезистентностью и предиабетом. Int J Environ Res Public Health 11: 2328–2345.
16. 16. Shih CC, Shlau MT, Lin CH, Wu JB (2014) Momordica charantia улучшает инсулинорезистентность и дислипидемию с изменением продукции глюкозы в печени и синтеза жирных кислот и фосфорилирования AMPK у мышей, получавших питание с высоким содержанием жира. Phytother Res 28: 363–371.
17. 17. Ван Х.Й., Кан В.К., Ченг Т.Дж., Ю Ш., Чанг Л.Х. и др.(2014) Дифференциальные антидиабетические эффекты и механизм действия богатого харантином экстракта тайваньской Momordica charantia у мышей с диабетом типа 1 и типа 2. Food Chem Toxicol 69: 347–356.
18. 18. Бао Б., Чен Ю.Г., Чжан Л., На Сюй Ю.Л., Ван Х и др. (2013) Momordica charantia (Горькая дыня) снижает инфильтрацию макрофагов и тучных клеток, связанных с ожирением, а также экспрессию воспалительных цитокинов в жировой ткани. PLoS ONE 8: e84075.
19. 19. Hsieh CH, Chen GC, Chen PH, Wu TF, Chao PM (2013) Измененный профиль белка белой жировой ткани у мышей C57BL / 6J, проявляющий делипидативные, воспалительные и потемневшие характеристики после обработки маслом семян горькой дыни.PLoS ONE 8: e72917.
20. 20. Saha SS, Ghosh M (2012) Антиоксидантный и противовоспалительный эффект конъюгированных изомеров линоленовой кислоты против диабета, индуцированного стрептозотоцином. Br J Nutr 108: 974–983.
21. 21. Dhar P, Ghosh S, Bhattacharyya DK (1999) Диетические эффекты уровней конъюгированной октадекатриеновой жирной кислоты (9 цис, 11 транс, 13 транс) на липиды крови и неферментативное перекисное окисление липидов in vitro у крыс. Липиды 34: 109–114.
22. 22. Падмашри А., Шарма Г.К., Семвал А.Д., Бава А.С. (2011) Исследования антиоксидантной активности горькой тыквы (Momordica charantia) и ее фракций с использованием различных моделей in vitro.J Sci Food Agric 91: 776–782.
23. 23. Kim HY, Sin SM, Lee S, Cho KM, Cho EJ (2013) Бутаноловая фракция горькой дыни (Momordica charantia) улавливает свободные радикалы и снижает окислительный стресс. Пред. Nutr Food Sci 18: 18–22.
24. 24. Gurbuz I, Akyuz C, Yesilada E, Sener B (2000) Антиулцерогенный эффект плодов Momordica charantia L. на различных моделях язв у крыс. Дж. Этнофармакол 71: 77–82.
25. 25. Озбакис Д.Г., Гурсан Н. (2005) Эффекты Momordica charantia L.(Cucurbitaceae) на модели индуцированной индометацином язвы у крыс. Turk J Gastroenterol 16: 85–88.
26. 26. Мардани С., Насри Х., Хаджиан С., Ахмади А., Каземи Р. и др. (2014) Влияние экстракта Momordica charantia на функцию и структуру почек у мышей. J Nephropathol 3: 35–40.
27. 27. Пискин А., Алтункайнак Б.З., Тюментемур Г., Каплан С., Язычи О.Б. и др. (2014) Благоприятное влияние Momordica charantia (горькая тыква) на заживление ран на коже кролика. J Dermatolog Treat 25: 350–357.
28. 28. Дхар П., Чаттопадхьяй К., Бхаттачарья Д., Ройчоудхури А., Бисвас А. и др. (2006) Антиоксидантный эффект конъюгированной линоленовой кислоты в крови диабетиков и недиабетиков: исследование in vitro. J Oleo Sci 56: 19–24.
29. 29. Chao CY, Yin MC, Huang CJ (2011) Экстракт дикой горькой тыквы активирует экспрессию мРНК PPARalpha, PPARgamma и их генов-мишеней у мышей C57BL / 6J. Дж. Этнофармакол 135: 156–161.
30. 30. Cao H (2011) Структурно-функциональный анализ последовательностей диацилглицерин-ацилтрансферазы из 70 организмов.BMC Res Notes 4: 249.
31. 31. Cao H, Shockey JM, Klasson KT, Chapital DC, Mason CB и др. (2013) Регуляция развития экспрессии генов семейства диацилглицерин-ацилтрансфераз в тканях тунгового дерева. PLoS ONE 8: e76946.
32. 32. Smith SW, Weiss SB, Kennedy EP (1957) Ферментативное дефосфорилирование фосфатидных кислот. J Biol Chem 228: 915–922.
33. 33. Csaki LS, Dwyer JR, Fong LG, Tontonoz P, Young SG, et al. (2013) Липины, липинопатии и модуляция клеточного хранения липидов и передачи сигналов.Prog Lipid Res 52: 305–316.
34. 34. Кеннеди Е.П., Вайс С.Б. (1956) Функция коферментов цитидина в биосинтезе фосфолипидов. J Biol Chem 222: 193–214.
35. 35. Kocsis MG, Weselake RJ (1996) Фосфатидатфосфатазы млекопитающих, дрожжей и высших растений. Липиды 31: 785–802.
36. 36. Butterwith SC, Hopewell R, Brindley DN (1984) Частичная очистка и характеристика растворимой фосфатидатфосфогидролазы печени крысы.Biochem J 220: 825–833.
37. 37. Лин Ю.П., Карман Г.М. (1989) Очистка и характеристика фосфатидатфосфатазы из Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 264: 8641–8645.
38. 38. Han GS, Wu WI, Carman GM (2006) Гомолог липина Saccharomyces cerevisiae представляет собой Mg2 + -зависимый фермент фосфатидатфосфатазы. J Biol Chem 281: 9210–9218.
39. 39. Ullah AHJ, Sethumadhavan K (2013) Идентификация растворимой фосфатидатфосфогидролазы в развивающихся семядолях Momordica charantia .Успехи в биологической химии 3: 11–17.
40. 40. Cao H, Chapital DC, Howard OD Jr, Deterding LJ, Mason CB, et al. (2012) Экспрессия и очистка рекомбинантной диацилглицерин-ацилтрансферазы тунгового дерева 2. Appl Microbiol Biotechnol 96: 711–727.
41. 41. Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Grimm C, Shockey J (2012) Исследования по очистке, характеристике и биоинформатике фосфогидролазы фосфатидной кислоты из Lagenaria siceraria . Успехи в биологической химии 2: 403–410.
42. 42. Cao H, James MG, Myers AM (2000) Очистка и характеристика растворимых синтаз крахмала из эндосперма кукурузы. Arch Biochem Biophys 373: 135–146.
43. 43. Озбун JL, Hawker JS, Preiss J (1971) Аденозиндифосфоглюкозо-крахмальные глюкозилтрансферазы из развивающихся зерен восковой кукурузы. Физиология растений 48: 765–769.
44. 44. Heinonen JK, Lahti RJ (1981) Новое и удобное колориметрическое определение неорганического ортофосфата и его применение для анализа неорганической пирофосфатазы.Анальная биохимия 113: 313–317.
45. 45. Ullah AH, Cummins BJ (1987) Очистка, N-концевая аминокислотная последовательность и характеристика оптимальной кислой фосфатазы pH 2,5 (E.C. 3.1.3.2) из ​​Aspergillus ficuum. Prep Biochem 17: 397–422.

Горькая тыква, Бальзамная груша: Аптека на заборе

Горькая тыква, съедобная, только когда она зеленая и приготовленная

Горькая дыня, горькая тыква, бальзамная груша:

Если бы не существовало бальзамной груши, ее изобрела бы фармацевтическая компания.Фактически, в прошлом году было опубликовано около десяти исследований по этому поводу, последнее на момент написания этой статьи в феврале 2008 года в журнале Journal of Food Biochemistry о его потенциале в лечении диабета.

Бальзамная груша, очень распространенный горький овощ в азиатской кухне, Momordica charantia , является естественной аптекой для диабетиков и других людей. Это вовсе не груша, а плодоносящая тыква и виноградная лоза, пахнущая старой, хорошо использованной спортивной обувью. Не говорите, что вас не предупреждали.

Молодые, зеленые плоды вареные съедобные

Бородавчатая тыква съедобна, когда она зеленая (и приготовленная), но становится токсичной / лекарственной, когда созревает апельсин. Затем он обычно разделяется на три части, обнажая красные кожуры (мясистые покровы семян). Созревшие семена внутри кожуры и апельсиновой мякоти тыквы токсичны и могут вызвать сильную потерю жидкости с обоих концов и вызвать выкидыш. Однако красные кожухи вокруг семян съедобны. И обратите внимание: на 96% зёрнышки состоят из ликопина, что придает им цвет.Только не забудьте выплюнуть семечко из каждой плодоножки.

Желтый или оранжевый плод токсичен

M. charantia встречается в Коннектикуте к югу от Флориды, к западу от Техаса, а также к Пуэрто-Рико и Гавайским островам. Между прочим, горькая дыня содержит в два раза больше калия, чем бананы, а также богата витаминами А и С.

Латинское название рода Momordica (мо-МОР-ди-ка) означает «кусать» и относится к зазубренным краям листьев, которые выглядят так, как будто они были укушены. Charantia (char-AN-tee-ah) название вида происходит от греческого, что означает красивый цветок. Он произрастает в тропических регионах мира, хотя никто не знает, откуда он появился, скорее всего, это тропики Старого Света. В «Руководстве по ботанике» Грея толщиной в четыре дюйма, начатом в 1850 году и пересмотренном в 1950 году, не упоминается M. charantia в Соединенных Штатах, но в настоящее время это серьезный сорняк во Флориде и 21 другой культуре по всему миру. , бананы в соевые бобы. Он поздно приехал во Флориду, или Грей был в неведении.В Амазонии и даже в Индии он очень часто используется местным населением в качестве продуктов питания и лекарств. По всей видимости, это динамическая химическая фабрика, M. charantia проходит испытания для лечения рака, в частности лейкемии, СПИДа, в качестве анальгетика и для лечения резистентности к инсулину. Его часто называют растительным инсулином. Он не увеличивает секрецию инсулина, а «ускоряет использование углеводов клетками, воздействуя на липиды мембран». Похоже, у вонючей спортивной обуви, висящей на заборе, большое будущее.Но это не для всех: не ешьте овощи, если у вас гипогликемия или вы беременны. У диабетиков он может слишком эффективно снижать уровень сахара в крови. Он также снижает фертильность у мужчин и женщин. Кроме того, он содержит вицин: он может вызывать фавизм у людей, у которых есть вариант глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. (Полагаю, если вы не знаете, что это такое, у вас его нет. Фавизм — это серьезная реакция на бобы и / или их пыльцу. Чаще всего встречается у мужчин средиземноморского происхождения.)

Красный налет на семенах съедобен в сыром виде, но не семена

Культивируемые версии M.charantia , также называемая горькой тыквой или диким бальзамным яблоком, встречается на большинстве азиатских рынков, и они тоже пахнут старой спортивной обуви. К счастью, запах почти полностью исчезает при приготовлении, а горечь уменьшается, но не исчезает полностью. Если вы еще не достаточно смелы, чтобы выбрать свой собственный, вы можете купить его или вырастить самостоятельно. Есть много разновидностей и многочисленные рецепты в Интернете. M. charantia действительно горький. Некоторые режут овощи и замачивают их в воде или подсоленной воде и / или бланшируют, чтобы уменьшить горечь.(См. Рецепт ниже.)

Лист и цветок горькой тыквы

Хотя я никогда не видел, чтобы азиатская семья собирала M. charantia у местных заборов здесь, во Флориде, я видел, как многие латиноамериканские семьи делают это. Доктор Джулия Мортон, профессор растений из южной Флориды, говорит, что, помимо зеленых фруктов, молодые листья при приготовлении и сушке также съедобны и питательны, содержат железо, фосфор, кальций и витамин С. Мне никогда не удавалось пройти мимо шкафчика. комнатный букет, чтобы бросить их в горшок.Мякоть спелых фруктов использовалась в качестве заменителя мыла, что должно дать вам некоторое представление о вкусе. В Индии и Африке вареные листья консервируют, как шпинат. Ароматные цветы можно использовать в качестве приправы при готовке.

Между прочим, если у вас избыток зеленых горьких тыкв, вы можете нарезать их, частично отварить в подсоленной воде, а затем высушить на солнце или как-то иначе. Их хватит на несколько месяцев. Затем их можно жарить и использовать по своему усмотрению. Также некоторые натуропаты рекомендуют пить свежий горький сок.Это будет нелегко, это действительно горько … гораздо проще сказать кому-то сделать это, чем делать это самому. Также есть сообщение о том, что употребление сока винограда убило ребенка. Требуется осторожность.

ПОМНИТЕ: С моей точки зрения как собирателя никакие части Momordica charantia нельзя есть сырыми, кроме красных ягодиц (и не забудьте выплюнуть семена). съедено, когда оно созрело, то есть когда оно меняет цвет с зеленого на желтый и оранжевый.Не ешьте желтые или оранжевые фрукты сырыми или приготовленными. Это лекарственное или токсичное вещество. Тем не менее, позвольте мне уточнить это: я встречал людей, которые едят апельсиновую мякоть сырой и приготовленной, но у них есть различные медицинские цели, которые выходят за рамки моей зарплаты и опыта. Для этого посетите некоторые публикации или сайты травников. Наконец, зеленый плод подозревают при отравлении собак и свиней.

Родственники: Momordica balsamina, с более длинными колючками на плодах и может созревать до красного цвета, растет только в Санкт-Петербурге.Округ Люси во Флориде и лишь в нескольких местах на юге США. Плоды M. balsamina можно мариновать или после замачивания использовать в качестве приготовленных овощей. Молодые побеги и усики отваривают как зелень. Семена едят в приготовленных молодых фруктах. Momordica cochinchinensis дает огромные круглые плоды, которые при созревании становятся красными. Молодые плоды вареные, не такие горькие, как M. charantia . Momordica dioica, маленький и округлый , ценится больше остальных.Он не горький, а сладкий. Плоды, побеги, листья и корни отваривают в пищу. Существует также по крайней мере семь коммерческих сортов бахчевых культур Momordica

ИДЕНТИФИКАЦИЯ: Momordica charantia : тонкая, вьющаяся однолетняя лоза высотой 18 футов с длинными черешками и желтыми цветами в месте пересечения листа со стеблем. Молодые плоды изумрудно-зеленые, при созревании переходящие в оранжевые. По мере созревания плод разделяется на три неправильные части, которые загибаются назад, показывая множество красновато-коричневых или белых семян, заключенных в алые дольки.

ВРЕМЯ ГОДА: фрукты, лето и осень в теплом климате, осень в северных странах.

ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА: Люблю лазать в гамаках, на нарушенных участках, в торфяных и декоративных ландшафтах и ​​в цитрусовых рощах. Кажется, это самая распространенная лоза на заборах во Флориде.

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ: Ничего спелого, кроме черенков. Зеленые плоды (в том числе семена) отварные, листья и побеги, отварные дважды. Или разрежьте и удалите семена, волокна и пропарку. Ядовитые спелые части слишком горьки, чтобы их можно было есть.(Взрослый человек может проглотить два спелых семени и не испытывать особого беспокойства.) Молодые листья и побеги варят и едят как зелень. Цветы используют как приправу.

ТРАВЫ БЫТЬ

Травники говорят, что харантия уже давно используется для лечения диабета и множества других заболеваний, от артрита до желтухи.

Карела Бхаджи Жареная горькая тыква

1 фунт индийской или китайской горькой дыни
1 ½ чайной ложки соли, разделенной, по вкусу
1 столовая ложка топленого масла
2 столовые ложки масла авокадо
½ чайной ложки семян тмина
¼ чайной ложки семян фенхеля
1 дюйм имбиря, тертого
2 зубчика чеснока, рубленый
1 мелко нарезанная луковица
½ чайной ложки гарам масала
½ чайной ложки молотого кориандра
¼ чайной ложки молотой куркумы
¼ чайной ложки красного перца чили кашмири
¼ чайной ложки черного перца, больше по вкусу
1 чайная ложка порошка амчура (зеленого манго)
2 чайные ложки сахар из кокосовой пальмы
½ стакана куриного бульона
свежая нарезанная кинза для украшения

1.Разрежьте горькую дыню пополам вдоль; ложкой соскоблите и выбросьте семена и сердцевину. Нарежьте дыню ломтиками ¼ дюйма, затем переложите на дуршлаг, подвешенный над миской; посыпать 1 ч.л. соли и процедить 30 минут. Осторожно отожмите и промокните дыню насухо, чтобы извлечь из нее горький сок.

2. Нагрейте топленое масло и масло в большой сковороде на среднем или сильном огне до мерцания; добавьте семена тмина и семена фенхеля и поджарьте до появления аромата около 30 секунд.Вмешайте чеснок и имбирь и обжарьте еще 30 секунд до получения аромата, затем уменьшите огонь до среднего и добавьте лук, кориандр, куркуму, порошок чили, перец и оставшиеся ½ чайной ложки соли. Обжарить, пока лук не станет мягким, около 6 минут. Добавьте горькую дыню и куриный бульон и обжаривайте до тех пор, пока дыня не станет мягкой, а жидкость не испарится, около 10 минут, часто помешивая.

3. Вмешать амчурскую пудру и сахар; увеличьте огонь до сильного и жарьте на сковороде, пока вся жидкость не испарится, а дыня и лук не начнут хрустеть, около 3 минут, часто помешивая, чтобы предотвратить подгорание.Приправить солью и перцем по вкусу, затем подавать с кинзой.

Характеристика растворимой фосфатазы фосфатидной кислоты в горькой дыне (Momordica charantia)

Реферат

Momordica charantia часто называют горькой дыней, горькой тыквой или горькой тыквой, потому что ее плоды имеют горький вкус. Фрукты широко используются в овощных и лечебных травах. Альфа-элеостеариновая кислота является основной жирной кислотой в семенах, но мало что известно о ее биосинтезе.В качестве первого шага к пониманию биохимического механизма накопления жирных кислот в семенах горькой дыни, это исследование было сосредоточено на растворимой фосфатазе фосфатидовой кислоты (PAP, 3-sn-фосфатидатфосфогидролаза, EC 3.1.3.4), которая гидролизует фосфомоноэфирную связь в фосфатидат с образованием диацилглицерин и P _i . PAP обычно делятся на два подсемейства: Mg ²⁺ -зависимый растворимый PAP и Mg ²⁺ -независимый мембранно-связанный PAP. Мы сообщаем здесь о частичной очистке и характеристике Mg ²⁺ -независимой активности PAP в развивающихся семядолях горькой дыни.Белок PAP был частично очищен последовательным центрифугированием на колонках UNOsphere Q и S от растворимого экстракта. Активность PAP была оптимизирована при pH 6,5 и 53–60 ° C и не подвергалась влиянию до 0,3 мМ MgCl ₂ . Значения K _m и V _max для диолеоилфосфатидной кислоты составляли 595,4 мкМ и 104,9 мкат / мг белка, соответственно. Активность PAP ингибировалась NaF, Na ₃ VO ₄ , Triton X-100, FeSO ₄ и CuSO ₄ , но стимулировалась MnSO ₄ , ZnSO ₄ и Co (NO ₃ ). ) ₂ .Анализ активности в геле и масс-спектрометрия показали, что активность PAP была очищена с рядом других белков. Это исследование предполагает, что белок PAP, вероятно, связан с другими белками в семенах горькой дыни и что новый класс PAP существует как растворимый и Mg ²⁺ -независимый фермент в растениях.

Введение

Momordica charantia часто называют горькой дыней, горькой тыквой или горькой тыквой, потому что ее плоды имеют горький вкус. Это тропическая и субтропическая виноградная лоза семейства Cucurbitaceae , широко выращиваемая в Азии, Африке и Карибском бассейне.Растение представляет собой травянистую усиковую лозу длиной до 5 м. Цветение горькой дыни происходит в июне-июле, а плоды появляются в сентябре-ноябре в Северном полушарии. Плод имеет отчетливую бородавчатую внешность и продолговатую форму. Он полый в поперечном сечении с относительно тонким слоем мякоти, окружающим центральную семенную полость, заполненную крупными плоскими семенами и сердцевиной. Плоды обычно употребляют на стадии зеленого или раннего пожелтения. Мякоть плода хрустящая, водянистая по текстуре и на этих стадиях горькая на вкус.Кожица нежная и съедобная. Семена и сердцевина незрелых плодов кажутся белыми, не очень горькие и могут быть удалены перед приготовлением. Горькая дыня часто используется в китайской кулинарии из-за ее горького вкуса, обычно в жарком, супах и травяных чаях. Он также использовался в качестве горького ингредиента в некоторых сортах китайского и окинавского пива. Семена горькой дыни богаты жирными кислотами и минералами, включая железо, бета-каротин, кальций, калий и многие витамины. Композиции жирных кислот масла горькой дыни включают 37% насыщенных жирных кислот, в основном стеариновую кислоту; 3% мононенасыщенных жирных кислот, преимущественно линолевая, и 60% полиненасыщенных жирных кислот, преимущественно альфа-элеостеариновая кислота (α-ESA, 9 цис , 11 транс , 13 транс октадекатриеновая кислота), что составляет 54% общие жирные кислоты [1].

Горькая дыня издавна использовалась в качестве лечебного средства в Азии и Африке. Он использовался в качестве стимулятора аппетита, лечения желудочно-кишечных инфекций и для снижения уровня сахара в крови у диабетиков в традиционной китайской медицине. Недавние исследования продемонстрировали потенциальное использование масла горькой дыни с широким спектром пищевых и медицинских применений из-за его противоракового действия [2] — [10], антидиабетической активности [11] — [19], противовоспалительного действия. эффект [20], антиоксидантная активность [21] — [23], противояльцерогенный эффект [24] — [26] и ранозаживляющий эффект [27].Альфа-ЭСК, конъюгированная линоленовая кислота, может быть ключевым биологически активным соединением в масле семян. Альфа-ESA из семян горькой дыни оказывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки [6], индуцирует апоптоз и активирует GADD45, p53 и PPARγ в клетках Caco-2 рака толстой кишки человека [3], блокирует пролиферацию клеток рака груди и вызывает апоптоз посредством механизма, который может быть зависимым от окисления [2], защищает плазму, липопротеины низкой плотности и мембраны эритроцитов от окисления, что может быть эффективным для снижения риска ишемической болезни сердца при сахарном диабете [28], и нерегулирует экспрессию мРНК PPARα, PPARγ и их генов-мишеней в Мыши C57BL / 6J [29].Эти исследования показывают, что α-ESA обладает противораковой, антидиабетической и противовоспалительной активностью, подавляет пролиферацию опухолевых клеток, снижает содержание жира в крови и предотвращает сердечно-сосудистые заболевания.

В настоящее время мало что известно о ферментативном механизме биосинтеза α-ESA в семенах горькой дыни. В общем, ацилтрансферазы, включая диацилглицеринтрансферазы [30], [31], добавляют жирные ацильные группы последовательно к sn-1, sn-2 и sn-3 положениям глицерин-3-фосфата (G3P) с образованием триацилглицерина (TAG).Этот путь обычно называют путем Кеннеди или G3P [32]. Ключевым этапом биосинтеза ТАГ является дефосфорилирование положения sn-3 фосфатидата (PtdOH), катализируемое фосфатазой фосфатидной кислоты (PAP или липинами), с образованием диацилглицерина (DAG) и неорганического фосфата (P _i ) () [33] . PtdOH синтезируется под действием глицерофосфатацилтрансферазы (GPAT) и ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты (LPAAT). Образование DAG считается предпоследним ключевым этапом пути Кеннеди, потому что это критический метаболит для синтеза TAG, фосфатидилэтаноламина (PtdEtn) и фосфатидилхолина (PtdCho) [33] — [35].

Фермент гидролизует фосфоэфирную связь PtdOH и генерирует DAG и P _i .

В качестве первого шага к пониманию биохимического механизма накопления жирных кислот в семенах горькой дыни мы сосредоточили наши исследования на PAP (3-sn-фосфатидатфосфогидролазе, EC 3.1.3.4), которая дефосфорилирует фосфатидную кислоту (PA, также называемую PtdOH). для создания DAG и P _i .Ферменты семейства PAP в настоящее время классифицируются как растворимые PAP [36] или мембраносвязанные PAP [37]. Основываясь на требовании к активности Mg ²⁺ , фермент также можно разделить на 2 класса: Mg ²⁺ -зависимый и Mg ²⁺ -независимый PAP [38]. Обычно растворимый PAP является Mg ²⁺ -зависимым; тогда как мембраносвязанный PAP не зависит от Mg ²⁺ . Недавно мы идентифицировали растворимый PAP в семядолях горькой дыни [39]. Мы сообщаем здесь о частичной очистке и характеристике PAP из развивающихся семядолей горькой дыни как растворимого и Mg ²⁺ -независимого фермента.

Результаты и обсуждение

Субклеточное распределение активности PAP в семядолях горькой дыни

Ферменты семейства PAP в настоящее время классифицируются как растворимые PAP или мембраносвязанные PAP [36]. Дифференциальное центрифугирование использовали для разделения фракций цитозоля и микросомальной мембраны для определения субклеточной локализации активности PAP в Momordica charantia (горькая дыня, горькая тыква или горькая тыква). Экстракт семядолей последовательно центрифугировали при 3000 г , 18000 г и 105000 г .Конечный осадок и супернатант после ультрацентрифугирования обычно рассматриваются как микросомальные мембраны и цитозоль соответственно [40]. Активность PAP в осадке 105000 г (осадок P3) составляла только 11% от общей активности PAP (). После диализа и центрифугирования супернатанта осадок S3 содержал только 1,8%, тогда как супернатант S3 содержал 87,2% общей активности (). Это субклеточное распределение активности PAP ясно продемонстрировало, что большая часть активности PAP в семенах горькой дыни растворима и локализуется в цитозоле.

(A) горькая дыня индийского происхождения использовалась в исследовании. (B) Распределение активности PAP в горьких спелых семядолях. Экстракт семядолей последовательно центрифугировали при 3000 г , 18000 г и 105000 г . Конечный осадок (осадок P3) после ультрацентрифугирования обычно рассматривается как микросомальные мембраны. После диализа и центрифугирования супернатанта г 105000 г получали осадок S3 (загрязненные микросомы) и супернатант S3 (цитозоль).Все три фракции анализировали на активность PAP. Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

Очистка PAP

Белок PAP был частично очищен от семядолей горькой дыни с помощью комбинации колонок Q и ​​S. Активность фермента определяли двумя анализами: анализами активности PAP и фосфатазы. С помощью анализа активности PAP разделение растворимого PAP с колонкой Q привело к 3,2-кратной очистке с извлечением 90,3% от общей активности PAP (). Белок PAP не связывался с S-колонкой эффективно и 83.3% активности PAP было восстановлено в проточном потоке. Отделение белков от проточного потока второй колонкой Q немного повысило чистоту с 1,2-кратной удельной активностью по сравнению с загрузкой, и было восстановлено от общей активности (). После изменения условий связывания некоторое количество белка PAP было связано с S-колонкой, что привело к лучшей очистке (в 3 раза), но эта стадия снизила выход PAP при элюировании до 20% нагрузки (). Эта схема очистки генерировала белки PAP с общим коэффициентом очистки 12.5-кратный и выход 11,4% с использованием анализа активности PAP (). Более высокий коэффициент очистки (16 раз) и более высокий выход (14,5%) очистки PAP были получены из тех же образцов белка при использовании анализа активности фосфатазы (). Дальнейшая очистка смолой Affigel Blue не привела к какому-либо улучшению чистоты и фактически снизила общую активность PAP (данные не показаны). Выход и удельная активность PAP из горькой дыни намного выше, чем у PAP, очищенного из Lagenaria siceraria (тыквенная тыква, тыква опо или длинная дыня) [41].Дополнительные стадии очистки привели к значительной потере активности, а выход белка был низким, вероятно, из-за PAP-ассоциированного с другими белками (см. Ниже).

Таблица 1

Очистка PAP из семядолей горькой дыни.

Линейность анализов PAP

При первоначальной характеристике частично очищенного фермента PAP линейность между временем инкубации и активностью PAP наблюдалась в 50 мМ имидазоловом буфере, содержащем 0.3 мМ MgCl ₂ , pH 6,5 (). Подобная линейность ферментативной реакции наблюдалась в зависимости от количества ферментов, используемых в анализе (). Подбор данных показал, что коэффициент детерминации (R2) был выше 0,99 в обоих анализах, что свидетельствует о большой корреляции между активностью PAP и временем реакции или количеством используемого фермента. Эти результаты анализа предполагают, что установленные анализы подходят для характеристики частично очищенного PAP из горькой дыни.

Активность PAP анализировали с использованием аликвот белков из второй фракции S-колонки после очистки PAP. (A) Активность PAP в зависимости от времени реакции. Анализ выполняли при 53 ° C в течение различного времени с 500 мкМ DPA и 0,3 мМ MgCl ₂ . Аликвоты ферментативных реакций отбирали для измерения в указанные моменты времени. (B) Активность PAP в зависимости от количества фермента. Анализ проводили при 53 ° C с использованием различных количеств препарата PAP с 500 мкМ DPA и 0,3 мМ MgCl ₂ .Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

Оптимумы pH и температуры PAP

Оптимумы pH PAP наблюдались при pH 6,5 в условиях анализа с использованием 5 мкл фермента и 500 мкМ диолеоилфосфатидной кислоты (DPA) в 50 мМ имидазоловом буфере, содержащем 0,3 мМ MgCl. ₂ (). Температурный оптимум находился в диапазоне от 53 до 60 ° C (). Эти оптимальные значения pH и температуры немного выше, чем у неочищенного экстракта [39]. Из этого исследования не ясно, почему температурный оптимум необычно выше, чем у других метаболических ферментов, таких как растворимые синтазы крахмала из зерен кукурузы [42].

Анализ проводили при 53 ° C в течение 30 минут с использованием 5 мкл препарата PAP с 500 мкМ DPA и 0,3 мМ MgCl ₂ . (A) Профиль pH фермента PAP, катализирующего PtdOH. (B) Температурный профиль фермента PAP, катализирующего PtdOH. Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

Mg

На основании требований к активности Mg ²⁺ ферменты семейства PAP, включая липины и липидфосфатфосфатазы (LPP), делятся на 2 класса: Mg ²⁺ -зависимый PAP и Mg ²⁺ -независимый PAP [38].Известно, что дрожжи и беспозвоночные имеют один ортолог липина, но у растений есть два гена PAP / липина, а у млекопитающих — три гена липина [33]. Члены семейства липинов PAP являются растворимыми ферментами, и для их активности требуется Mg ²⁺ . LPP также проявляют активность PAP, но они структурно не связаны с липиновыми белками. LPP локализованы на плазматической мембране и не требуют Mg ²⁺ для своей активности. Мы определили влияние Mg ²⁺ на активность PAP с использованием очищенного PAP.Наши результаты показали, что на активность PAP не влияет или минимально влияет до 0,3 мМ MgCl ₂ в тестовых смесях (). Были измерены эффекты ионных хелатеров EDTA и EGTA на активность PAP. Однако оба хелатора не оказывали значительного влияния на активность PAP (данные не показаны). Этот результат дополнительно подтвердил, что активность растворимого PAP не зависит от Mg ²⁺ в экстракте горькой дыни. Эти результаты анализа подтверждают предыдущие наблюдения неочищенного экстракта горькой дыни и частично очищенного PAP тыквы, что эти PAP являются Mg ²⁺ -независимым ферментом [39], [41].Общие результаты предполагают, что в горькой дыне и бутылочной тыкве существует новый класс PAP, который представляет собой растворимый и независимый от Mg ²⁺ фермент.

Анализ проводили при 53 ° C, pH 6,5 в течение 30 мин с использованием 5 мкл препарата PAP с 500 мкМ DPA и различных концентраций MgCl ₂ . Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

Кинетические параметры PAP

Кинетические параметры PAP определяли с использованием очищенного белка и DPA в качестве субстрата в оптимизированных условиях анализа (pH 6.5, 53 ° C и 0,3 мМ MgCl ₂ ). Фермент давал типичную сигмоидальную кривую для субстрата (). Значения K _m и V _max для DPA составляли 595,4 мкМ и 104,9 мкат / мг белка, соответственно. Эти значения K _m и V _max для очищенного PAP из горькой дыни были приблизительно в 4 и 56 раз, соответственно, по сравнению с значениями, полученными из неочищенного экстракта горькой дыни [39]. Эти значения K _m и V _max для очищенного PAP из горькой дыни были примерно в 3 раза выше, чем для частично очищенного PAP из бутылочной тыквы [41].Различия в кинетических параметрах PAP между препаратами частично очищенного PAP и неочищенного PAP согласуются с некоторыми наблюдениями из предыдущих публикаций. Ожидается, что значения V _max очищенных или частично очищенных ферментов намного выше, чем значения неочищенных ферментных препаратов, поскольку значения V _max рассчитаны на основе количества белков, используемых в анализах. Также наблюдается, что значения K _m очищенных ферментов выше, чем значения неочищенного ферментного препарата.Например, ранее мы наблюдали, что значение K _m частично очищенной синтазы крахмала II примерно в 2,5 раза выше, чем у неочищенных экстрактов [42], [43].

Анализ проводили при 53 ° C, pH 6,5 в течение 10 минут с использованием различных концентраций DPA. Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

Влияние ингибиторов фосфатазы, добавок и катионов на активность PAP

Три ингибитора фосфатазы были использованы для проверки их влияния на активность PAP.NaF частично ингибировал активность PAP. Ортованадат натрия подавлял активность PAP до 90%. Однако тартрат натрия не влиял на активность PAP в условиях анализа (). Triton X-100 значительно снижал активность PAP, но другие тестируемые добавки не влияли на его активность (). Эффекты катионов в буферах для анализа значительно изменили активность PAP. В частности, MnSO ₄ , ZnSO ₄ и Co (NO ₃ ) ₂ повышали активность PAP, но FeSO ₄ и CuSO ₄ снижали его активность ().

Анализы проводили при 53 ° C, pH 6,5 в течение 10 мин с использованием 5 мкл препарата PAP с 500 мкМ DPA. (A) Влияние ингибиторов фосфатазы на активность PAP. В качестве ингибиторов фосфатазы использовали NaF (1 мМ), тартрат натрия (4 мМ) и ортованадат натрия (2 мМ). (B) Влияние добавок на активность PAP. Конечная концентрация каждой добавки в буфере для анализа составляла 100 мМ, за исключением того, что TX-100 использовали в концентрации 10%.(C) Влияние катионов на активность PAP. Конечная концентрация каждого катиона в буфере для анализа составляла 0,3 мМ. Представленные данные представляют собой среднее значение 2 анализов для каждого образца.

Анализ активности PAP в нативном геле

Очищенные фракции PAP из колонки Affigel Blue содержали ряд совместно очищенных белков на SDS-PAGE (), но на нативном геле не наблюдалось четких полос белка (). Активность PAP анализировали с помощью анализа активности фосфатазы в геле. Активность геля показала, что полоса положительного контроля B-фикоэритрина была резкой, но полоса активности PAP отображала широкий диапазон полос мазка с очень большим размером на нативном геле ().Эти результаты предполагают, что белок PAP, вероятно, мультимерлизирован и / или связан с другими белками прямо и / или косвенно, что, вероятно, является одной из причин трудностей в дальнейшей очистке PAP до гомогенности.

(A) Денатурирующий гель-анализ очищенных фракций PAP с колонки Affigel Blue с помощью SDS-PAGE и окрашенных нитратом серебра. Дорожки 1 и 11, стандарты белка Bio-Rad Precision plus; переулки 2–4, 0.28, 0,55 и 0,83 мкг фракции №4; дорожки 5–7: 0,19, 0,37 и 0,56 мкг фракции №5; дорожки 8–10, 0,30, 0,60 и 0,90 мкг объединенных фракций 11–17. (B) Активность PAP, определенная с помощью анализа фосфатазы в геле с DiFMUP. Дорожки 1 и 8, B-фикоэритрин положительного контроля; дорожки 2–7, 0,5, 1, 3, 6, 10 и 12 мкг PAP из объединенной фракции. (C) Нативный гель-анализ очищенных фракций PAP, окрашенных кумасси синим. Дорожки 1 и 8 — стандарты неокрашенного белка нативных маркеров; дорожки 2–7, 0,5, 1, 3, 6, 10 и 12 мкг PAP из объединенной фракции.

Масс-спектральная идентификация PAP-ассоциированных белков

Мы попытались идентифицировать PAP-ассоциированные белки в очищенных фракциях с помощью масс-спектрометрии. Фракции PAP из второй колонки Q и колонки Affigel Blue объединяли и концентрировали для расщепления трипсином и эндопротеиназой GluC соответственно. Расщепленные пептиды разделяли с помощью ЖХ и идентифицировали с помощью МС / МС. MS-генерируемые мс-ионы искали по доступным базам данных последовательностей растений в библиотеке неизбыточных белков NCBI.ЖХ / МС / МС идентифицировали 10 и 24 PAP-ассоциированных белка в переваривании трипсина и GluC соответственно (). МС / МС идентифицировали четыре белка в переваривании трипсина и GluC, соответствующих инактивирующему рибосомы белку момордин I, ингибитору эластазы 4, малатдегидрогеназе и ингибитору трипсина 2 (). Однако ни одна из ms не соответствовала последовательностям PAP у других видов. Эти результаты MS / MS предполагают, что белок PAP, вероятно, связан с другими белками и что сам PAP является второстепенным компонентом в очищенной фракции.

Таблица 2

Анализ ЖХ / МС / МС совместно очищенных PAP белков из семядолей горькой дыни.

Заключение

Фосфатидная кислотная фосфатаза (PAPs) диаульфатиме-фосфатаз, фосфатицидная фосфатазная кислота, диафосфатирующая фосфатазная кислота, катализирует диафосфатирующее фосфатирование фосфатоцидной фосфатазы (PAP) с целью диафосфатирующего фосфатирования фосфатирующего фосфатаза (PAPs) шаг в синтезе ТАГ.PAP широко присутствуют в растениях, животных, микробах и людях. PAP обычно делятся на два подсемейства: Mg ²⁺ -зависимый растворимый PAP и Mg ²⁺ -независимый мембранно-связанный PAP. В этом исследовании мы предоставили доказательства существования нового класса фермента PAP в горькой дыне ( Momordica charantia ). Этот класс PAP растворим и не зависит от Mg ²⁺ . Белок PAP, вероятно, связан с другими белками масличных семян. Горькая дыня издавна использовалась в качестве лечебного средства.Молекулярная основа такого использования подтверждается недавними исследованиями, показывающими, что масло горькой дыни может использоваться в широком спектре пищевых и медицинских применений. Следовательно, понимание и регулирование активности PAP может привести к увеличению выхода масла горькой дыни. Выяснение функций PAP может привести к новым подходам к модуляции клеточного накопления липидов и метаболических заболеваний.

Материалы и методы

Растительный материал

Momordica charantia плода (горькая дыня) (индийского происхождения) были куплены в восточном продуктовом магазине в Новом Орлеане, штат Луизиана, США.Плоды были собраны примерно 6 дюймов в длину (средний уровень зрелости), что находится на идеальной стадии развития для потребления человеком. Семена извлекали из семенной полости плодов и промывали 0,9% ледяным физиологическим раствором. Наружные оболочки семян удаляли при комнатной температуре с помощью скальпеля, а семядоли удаляли вручную.

Приготовление тканевого экстракта

Все операции проводили при 4 ° C. Семядоли семян массой 91 г гомогенизировали в 100 мл буфера для экстракции (50 мМ NaOAc, pH 5.0, 150 мМ NaCl и 10 мМ MgCl ( ₂ ) с использованием политронного тканевого средства (Tekmar Tissumizer MarkII, Цинциннати, Огайо) на низкой, средней и высокой скорости в течение 30 с каждая. Гомогенат охлаждали на льду в течение 1 мин между взрывами. Гомогенат центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут и полученный супернатант (S1) центрифугировали при 18000 g в течение 30 минут при 4 ° C (Sorvall RC2B, Майами, Флорида). Этот супернатант (S2) ультрацентрифугировали при 105000 г в течение 60 минут при 4 ° C (Sorvall Discovery 100SE, Hitachi Ltd, Токио, Япония), и полученный супернатант (S3, цитозоль) и осадок (P3, микросомальные мембраны) обрабатывали. собраны.Супернатант S3 подвергали диализу для удаления Pi из экстракта семян против имидазольного буфера (25 мМ имидазольный буфер, pH 6,5, 1 мМ MgCl ₂ ) с тремя заменами буфера по 500 мл. Диализованный супернатант стал мутным после диализа, который удаляли центрифугированием при 18000 g в течение 30 минут при 4 ° C. Конечный супернатант (S3-супернатант) и осадок (S3-осадок), а также P3 использовали для определения субклеточного распределения активности PAP, а S3-супернатант использовали для очистки PAP.Содержание белка в супернатанте определяли методом бицинхониновой кислоты (BCA) (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Очистка PAP

Протокол очистки PAP включал четыре стадии хроматографии, состоящей из повторения колонок UNOsphere Q и S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Колоночную хроматографию выполняли при температуре окружающей среды 25 ° C с использованием хроматографической рабочей станции BioLogic LP (Bio-Rad Laboratories). Во время различных стадий очистки активные фракции были идентифицированы с помощью анализа PAP.Параллельный анализ фосфатазы с использованием п-нитрофенола также был проведен для подтверждения чистоты, поскольку было обнаружено, что фермент PAP обладает активностью фосфатазы, тогда как не все фосфатазы обладают активностью PAP. Все буферы, использованные на различных стадиях очистки, содержали 1 мМ MgCl ₂ . Вкратце, диализованный S3-супернатант экстракта семядолей горькой дыни наносили на колонку UNOsphere Q объемом 20 мл (2,5 × 4,0 см), уравновешенную 25 мМ имидазольным буфером, pH 6,5, при скорости потока 3.0 мл / мин. Затем колонку промывали тем же буфером с последующей ступенчатой ​​элюцией градиентом NaCl в имидазольном буфере (25 мМ, pH 6,5) в диапазоне от 0,2 до 0,4 М с шагом 0,05 М NaCl, а затем 0,5 и 1,0 М NaCl. Элюированные фракции с активностью PAP объединяли, подвергали диализу (25 мМ, pH 6,5) и наносили на колонку UNOsphere S объемом 20 мл (2,5 × 4,0 см), уравновешенную тем же буфером, при скорости потока 3,0 мл в минуту. Активность PAP была обнаружена в несвязанных фракциях. Для дальнейшей очистки использовали последовательные колонки UNOsphere Q и S (1 мл).Буфер и условия элюирования были такими же, за исключением того, что колонка S была проведена при pH 4,5 (25 мМ ацетатный буфер). Активность PAP была обнаружена в элюированных фракциях. Конечный белок с активностью PAP концентрировали ультрафильтрацией и использовали для анализа активности ферментов. Концентрированные белки дополнительно очищали на колонке Affigel Blue (Bio-Rad Laboratories) в 25 мМ имидазоле, pH 6,5 и 1 мМ MnSO ₄ . Подавляющее большинство активности PAP не было привязано к колонке. Активные фракции объединяли и концентрировали с помощью Amicon Ultra-0.Центробежные фильтры на 5 мл (Millipore Corporation, Billerica, MA) для SDS-PAGE, анализа активности фосфатазы в геле и расщепления протеазой.

Анализ активности PAP

Активность PAP определяли с помощью анализа высвобождения P _i и анализа фосфатазы. Эти анализы активности PAP горькой дыни были описаны ранее [39]. Для анализа высвобождения Pi использовали метод молибдата аммония-ацетон-кислота (AMA) [44]. Для стандартного анализа, если иное не указано ниже, 50 мкл фермента PAP добавляли к 900 мкл 50 мМ имидазольного буфера, pH 6.5 на водяной бане при 53 ° C. Ферментативную реакцию инициировали добавлением 50 мкл PtdOH / DPA (диолеоил-фосфатидная кислота или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфат, натриевая соль, Avanti Polar Lipids, Inc., Алабастер, Алабама), инкубировали в течение 30 мин и останавливали 2 мл реагента AMA. Лимонную кислоту (0,1 мл, 1,0 М) добавляли в каждую пробирку спустя 30 секунд для фиксации цвета с последующим центрифугированием при 13000 g в течение 7 минут (Eppendorf 5415C, Westbury, NY). Оптическую плотность при 355 нм измеряли после блокировки спектрофотометра соответствующим контролем, который был остановлен в нулевое время.Активность PAP выражали в нанокатали на миллилитр (ηкат / мл, ηмоль ортофосфата, высвобождаемого в секунду). Одна международная единица (МЕ) эквивалентна 16,67 нкат.

Для определения оптимума pH PAP горькой дыни использовали 25 мМ глицин-HCl (pH 1,5–3,0), 50 мМ ацетат натрия (pH 3,5–5,5) и 25 мМ имидазол (pH 6–9). Для измерения оптимальной температуры образцы инкубировали с субстратом при температуре от 20 до 70 ° C в 25 мМ имидазоле, pH 6,5. Оптимумы Mg ²⁺ определяли с помощью анализа фосфатазы с использованием до 3 мМ MgCl ₂ в тестовых смесях.Общие процедуры для характеристики PAP были аналогичны тем, которые использовались для синтаз растворимого крахмала [42].

Активность фосфатазы

Для анализа фосфатазы фермент PAP (от 2 до 10 мкл) добавляли к объему 950 мкл буфера (50 мМ имидазол, pH 6,5) и инкубировали при 53 ° C в течение 2–5 минут с 1,25 ммолями. ρ-нитрофенилфосфата (ρNPP) в конечном объеме 1,0 мл. Реакцию прекращали добавлением 0,1 мл 1,0 н. NaOH и высвободившийся ρ-нитрофенол измеряли спектрофотометрически при 400 нм [45].

Кинетика PAP

K _m и V _max для PAP горькой дыни с использованием анализа высвобождения P _i определяли при 53 ° C и pH 6,5, как указано выше. Концентрация DPA составляла от 0 до 500 мкМ. Программное обеспечение WindowChem Enzyme Kinetics версии 1.1 (Фэрфилд, Калифорния) использовалось для вычисления значений K _m и V _max .

Денатурирующий гель-электрофорез

Очищенный препарат фермента PAP из колонки Affigel Blue анализировали с помощью SDS-PAGE (200 В и 70 мин) с использованием Xcell II, Mini-Cell и 4–12% гелей Novex NuPage Bis-Tris с MOPS as рабочий буфер (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк).Разделенные белковые полосы визуализировали с помощью набора для окрашивания серебром Pierce с использованием предварительно окрашенных многоцветных маркеров молекулярной массы (от 4 до 250 кДа) в качестве стандартов размера (Thermo Scientific).

Нативный гель-электрофорез и анализ активности фосфатазы в геле

Очищенный препарат фермента PAP также был проанализирован с помощью нативного геля для анализа активности PAP в геле с использованием Xcell II, Mini-Cell и 3–12% гелей Novex NuPage Bis-Tris с собственным рабочим буфером NuPAGE (Life Technologies). В нативный гель загружали 0.5–12 мкг белков, очищенных на колонке Affigel Blue. Полосы белка на геле визуализировали окрашиванием кумасси синим (Simple Blue SafeStain, Life Technologies), используя стандарты неокрашенного белка с нативной меткой (от 20 до 1236 кДа) в качестве стандартов размера (Thermo Scientific). Активность PAP на неокрашенном нативном геле определяли с использованием 6,8-дифтор-4-метилумбеллиферилфосфата (DiFMUP) в качестве субстрата и B-фикоэритрина в качестве положительного контроля (Life Technologies). Анализ активности проводили путем инкубации нативного геля в 3 мл реакционной смеси, содержащей 0.5 мМ DiFMUP, 50 мМ имидазол, pH 6,5, 3 мМ MnCl ₂ и 100 мМ DTT при 37 ° C в течение 5 мин.

Расщепление очищенного фермента PAP трипсином

Фракцию фермента из колонки Affigel Blue концентрировали в концентраторе Centricon (Amicon, центробежные фильтрующие устройства, Millipore Corporation), и в ходе этого процесса имидазольный буфер заменяли на буфер для расщепления протеазы (50 мМ аммоний карбонат, pH 8,0). Триптические гидролизаты готовили в соответствии с инструкциями к набору для триптического гидролиза и гуанидинирования в растворе (Thermo Scientific).Вкратце, PAP-содержащие белки (5-10 мкг) добавляли к 15 мкл буфера для переваривания, содержащего 5,6 мМ DTT, в общем объеме 27 мкл в микроцентрифужной пробирке. Перевариваемую смесь инкубировали при 95 ° C в течение 5 минут. Для алкилирования белков к смеси добавляли 3 мкл 100 мМ йодацетамида и хранили при комнатной температуре в темноте. В каждую пробирку добавляли 2 мкл активированного трипсина (100 мкг / мкл) и инкубировали при 37 ° C в течение 3 часов с последующим добавлением 1 мкл трипсина к смеси для переваривания и инкубировали еще 2 часа для лучшего переваривания.Продукты переваривания гуанидилировали для превращения лизина в гомоаргинин путем добавления 10 мкл 30% NH ₄ OH и 6 мкл реагента гуанидирования (50 мг гемисульфата O-метилизомочевины в 51 мкл H ₂ O) и инкубировали при 65 ° C в течение 12 мин. Реакцию останавливали добавлением 3 мкл трифторуксусной кислоты (TFA) и хранили при –20 ° C перед анализом ЖХ / МС / МС.

Расщепление очищенного фермента PAP эндопротеиназой GluC

Фракцию фермента из колонки Affigel Blue концентрировали в концентраторе Centricon (Amicon, центробежные фильтрующие устройства, Millipore Corporation), и в то же время буфер заменяли на буфер расщепления протеазы (50 мМ карбонат аммония, pH 7.8). Переваривание эндопротеиназы GluC готовили в соответствии с инструкциями производителя (New England Biolabs, Бостон, Массачусетс). Вкратце, PAP-содержащие белки (10–20 мкг) смешивали с 0,5 мкг эндопротеиназы GluC и инкубировали при 37 ° C в течение 16 часов. Реакцию останавливали добавлением 6 мкл TFA и хранили при –20 ° C перед анализом ЖХ / МС / МС.

Разделение пептидов, масс-спектральное секвенирование и поиск в базе данных

Расщепленные протеазы анализировали с помощью ЖХ / МС / МС, состоящего из системы ВЭЖХ Agilent 1200, интерфейса Agilent Chip-cube и тандемного масс-спектрометра Agilent 6520 Q-TOF ( Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния).Пептиды разделяли с использованием Chip, состоящего из колонки для обогащения 40 нл и аналитической колонки 43 мм, заполненной C ₁₈ (шарики 5 мкм с порами 300 Å). Аликвоту образца объемом 1 мкл переносили в колонку для обогащения с помощью капиллярного насоса, работающего при скорости потока 4 мкл / мин. Нанонасос работал при скорости потока 600 нл / мин. Начальный градиент 97% растворителя A (0,1% муравьиной кислоты в H ₂ O) и 3% растворителя B (90% ацетонитрила / 0,1% муравьиной кислоты в H ₂ O) был изменен на 60% растворитель A при 12 мин, 20% через 13 мин и выдержку до 15 мин.Для уравновешивания колонки использовали дополнительное время 3 мин. Источник МС работал при 300 ° C с потоком 5 л / мин N ₂ и напряжением фрагментатора 175 В. В качестве газа столкновения использовался N ₂ , энергия столкновения которого варьировалась в зависимости от массы и заряда с использованием крутизна 3,7 В / 100 Да и смещение 2,5 В. Как счетверенные, так и времяпролетные (TOF) работали в режиме положительных ионов. Контрольные соединения 322,048121 Да и 1221,9

Да постоянно просачивались в источник для калибровки массы.Первоначальное сканирование MS было выполнено от m / z 300 до 1600, и до трех многозарядных ионов были автоматически выбраны для анализа MS / MS. После первоначального запуска была сделана вторая инъекция, исключая ионы, ранее предназначенные для анализа МС / МС. ЖХ-хроматограммы и масс-спектры исследовали с использованием программного обеспечения Mass-Hunter (версия B.0301; Agilent Technologies). Файлы данных были перенесены на рабочую станцию ​​Agilent, оснащенную программным обеспечением Spectrum Mill (Agilent Technologies). Необработанные файлы данных MS / MS были извлечены, секвенированы и проанализированы в библиотеке неизбыточных белков Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Профиль антиоксидантов экстракта плодов Momordica charantia проанализирован с использованием метаболомики на основе LC-MS-QTOF

Основные моменты

•

80 % этанольного экстракта плодов M. charantia проявил наибольшую антиоксидантную активность.

Бревифолинкарбоновая кислота — это новое антиоксидантное соединение, обнаруженное в плодах Momordica charantia .

3-Малонилмомордицин I и гоягликозид G обладают антиоксидантной активностью.

Abstract

Плод Momordica charantia считается полезным для здоровья. Несмотря на это потенциальное заявление, фитохимические исследования этого фрукта все еще отсутствуют. Таким образом, это исследование было направлено на оценку антиоксидантного профиля плода Momordica charantia (Cucurbitaceae). Антиоксидантная активность этанольных экстрактов различной полярности была оценена, и метаболиты, ответственные за ее активность, были определены с использованием метаболомического подхода.Шесть различных смесей этанола в воде, которые составляют 0%, 20%, 40%, 60%, 80% и 100% (об. / Об.), Были экстрагированы с использованием образца плодов с двумя семенами. Жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, квадрупольное время пролета и многомерный анализ данных использовались для идентификации метаболитов, которые были либо антиоксидантами, либо прооксидантами. 80% этанольный экстракт проявил наибольшую антиоксидантную активность при тестировании как 2, 2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH), так и антиоксидантной способности восстановления трехвалентного железа (FRAP).Этот экстракт показал наиболее интенсивные сигналы LC-MS, представленные аскорбиновой кислотой, маргароловой кислотой, бревифолинкарбоновой кислотой, кверцетин-3-O-гликозидом, кугуацином H, кукурбитацином E, 3-малонилмомордицин I и гоягликозидом G, коррелирующими с антиоксидантной активностью. В этом исследовании впервые сообщается о существовании бревифолинкарбоновой кислоты в этом фрукте и об антиоксидантной активности 3-малонилмомордицина I и гоягликозида G. Кроме того, графики нагрузки выявили неизвестные соединения, обладающие антиоксидантной активностью, которые потенциально могут быть выделены в будущее исследование.

Ключевые слова

Антиоксиданты

DPPH

FRAP

LC-MS-QTOF

Metabolomics

Momordica charantia

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

13

Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирование статей

(PDF) Обзор основных фармакологических характеристик Momordica charantia

Int. J. Pharmacol., 11 (5): 405-413, 2015

Dhalla, N.С., К.С. Гупта, М. Састри и К. Malhotra,

1961. Химический состав плодов Momordica

charantia L. Ind. J. Pharmacol., 23: 128-131.

Дхар П., С. Гош и Д.К. Bhattacharyya, 1999. Диетические эффекты

конъюгированных октадекатриеновых жирных кислот

(9 цис, 11 транс, 13 транс) уровней на липиды крови и

неферментативное перекисное окисление липидов in vitro у крыс. Липиды,

34: 109-114.

Диксит, В.П., П. Ханна, С.К. Bhargava, 1978. Воздействие экстракта плодов

Momordica charantia L. на семенники

собаки. Planta Medica, 34: 280-286.

Датта, П.К., А.К. Чакраварти, США, Чоудхури и

С.С. Пакраши, 1981. Вицин, токсин, вызывающий фавизм, из

Momordica charantia Linn. семена. Indian J. Chem.,

20: 669-671.

Фанг, Э.Ф. и Т.Б. Ng, 2011. Горькая тыква

(Momordica charantia) — это рог изобилия: обзор

ее антидиабетических, анти-ВИЧ и противоопухолевых свойств

.Curr. Мол. Мед., 11: 417-436.

Фанг, Э.Ф. и Т.Б. Ng, 2012. Может ли горькая тыква

(Momordica charantia) стать новым средством лечения

рака человека? Med. Аром. Растения,

Vol. 1. 10.4172 / 2167-0412.1000e101

Feng, Z., W.W. Ли, Х.В. Юнг, С.З. Чен и

Ю.П. Wang et al., 1990. Кристаллы α-моморхарина:

Новый белок, инактивирующий рибосомы. J. Mol. Биол.,

214: 625-626.

Ганджу, К. и Б. Пури, 1959. Mentha longifolia. Биофлавоноиды

из индийских овощей и фруктов. Indian J. Med. Res.,

47: 563-570.

Гарау, К., Э. Каммингс, Д.А. Phoenix and J. Singh, 2003.

Благоприятный эффект и механизм действия Momordica

charantia при лечении сахарного диабета: мини-обзор

. Int. J. Diabetes Metab., 11: 46-55.

Gopalan, C., B.V.R. Шастри и С.C. Balasubramanian, 1993.

Питательная ценность индийских продуктов питания. 2-е изд., Национальный институт питания

, Индийский совет медицинских исследований, глава

Хайдарабад, Индия, стр: 1-10.

Gorinstein, S., O. Martin-Belloso, A. Lojek, M. Ciz и

R. Soliva-Fortuny et al., 2002. Сравнительное содержание

некоторых фитохимических веществ в испанских яблоках, персиках и

грушах . J. Sci. Продовольственное сельское хозяйство., 82: 1166-1170.

Grover, J.K., S.S.Рати и В. Ватс, 2002. Улучшение

экспериментальной диабетической невропатии и гастропатии

у крыс после перорального введения экстрактов растения

(Eugenia jambolana, Mucurna pruriens и Tinospora

cordifolia). Indian J. Expt. Biol., 40: 273-276.

Grover, J.K. и С.П. Ядав, 2004. Фармакологические действия

и потенциальное использование Momordica charantia: обзор.

J. Ethnopharm., 93: 123-132.

Гунасекар, М., 2011. Противораковые эффекты Momordica

charantia in vitro. Кандидат наук. Диссертация, Центральный университет

Ланкашир, Престон.

Гурбуз, И., К. Акюз, Э. Ешилада и Б. Сенер, 2000.

Антиулцерогенный эффект плодов Momordica charantia L.

на различных моделях язв у крыс. J. Ethnopharmacol.,

71: 77-82.

Ханда, Г., Дж. Сингх, М.Л. Шарма, А. Каул и Р. Зафар,

1990. Гипогликемический принцип Momordica charantia

семян.Indian J. Nat. Произ., 6: 16-19.

Ханнум С.М., 2004. Потенциальное влияние клубники на здоровье человека

: научный обзор. Крит. Rev. Food

Sci. Nutr., 44: 1-17.

Хак, M.E., M.B. Алам и М.С. Hossain, 2011. Эффективность

тритерпеноидов, гликозидов кукурбитанового типа и фенольных соединений

, выделенных из Momordica charantia:

Обзор. IJPSR, 2: 1135-1146.

Heiser, Jr.C.B., 1979. Книга тыкв.Университет

Oklahoma Press, Норман, Оклахома, стр: 1-99.

Horax, R., N. Hettiarachchy and S. Islam, 2005. Всего

фенольных компонентов и компонентов фенольной кислоты в

4 разновидностях горьких дынь (Momordica charantia) и

антиоксидантной активности их экстрактов. J. Food Sci.,

70: C275-C280.

Хуанг, Х.Л., Ю.В. Хонг, W.H. Вонг, Ю. Чен,

J.H. Чюань, К.Дж. Хуанг и П.М.Chao, 2008. Горькая дыня

(Momordica charantia L.) подавляет гипертрофию адипоцитов

и подавляет экспрессию липогенных генов

в жировой ткани крыс с ожирением, вызванным диетой. Br. J. Nutr.,

99: 230-239.

Джаясоория, А.П., М. Саконо, К. Юкизаки, М. Кавано,

К. Ямамото и Н. Фукуда, 2000. Влияние

порошка Momordica charantia на уровни глюкозы в сыворотке и

различных липидных параметров у крыс, которых кормили с диетами без холестерина

и с повышенным содержанием холестерина.J. Etanopharmacol.,

72: 331-336.

Кханна, П., С.С. Джайн, А. Панагария, В.П. Dixit, 1981.

Гипогликемическая активность полипептида-P из растительного источника

. J. Nat. Prod., 44: 648-655.

Krawinkel, M.B. и Г. Кединг, 2006. Горькая тыква

Momordica charantia: диетический подход к гипергликемии

. Nutr. Rev., 64: 331-337.

Ли, S.Y., S.H. Эом, Ю. Ким, Н. Парк и С.У. Park,

2009. Тритерпеноиды кукурбитанового типа в Momordica

charantia Linn.J. Med. Растения Res., 3: 1264-1269.

Ли-Хуанг, С., П.Л. Хуанг, П. Нара, Х. Чен, Х.Ф. Кунг,

П. Хуанг и Х. Huang, 1990. MAP 30: новый ингибитор

инфекции и репликации ВИЧ-1. FEBS Lett.,

272: 12-18.

Ли-Хуанг, С., П.Л. Хуанг, П. Хуанг, А. Боуринбаяр,

H.C. Чен и Х.Ф. Кунг, 1995. Ингибирование интегразы

вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)

типа 1 растительными белками против ВИЧ MAP30 и GAP31.

Proc. Natl. Акад. Sci., 92: 8818-8822.

Лилапракаш, Г., Дж. К. Роуз, Б.М. Гаутам, П. Джавваджи и

A.S. Prasad, 2011. Антимикробное и антиоксидантное действие in vitro

активность листьев Momordica charantia. Pharmacophore,

2: 244-252.

Leung, K.C., Z.Q. Мэн и В.К.К. Ho, 1997. Антигенное определение

фрагментов α-моморхарина. Biochimica

Biophysica Acta (BBA) -Gen. Subj., 1336: 419-424.

Леунг, Л, Р.Биртвистл, Дж. Котека, С. Ханна и

С. Катбертсон, 2009. Антидиабетические и гипогликемические эффекты

Momordica charantia (горькая дыня): мини-обзор

. Брит. J. Nut., 102: 1703-1708.

411

www.ansinet.com | Том 11 | Выпуск 5 | 2015 |

(PDF) Биоактивные соединения и антиоксидантные свойства масел семян граната (Punica granatum L.) и горькой тыквы (Momordica charantia L.)

Yoshimeetal.

Food Sci. Technol, Campinas, Ahead of Print, 2018 9/10 9

, Lipid Science and Technology, 116 (5), 553-562. http: //dx.doi.

org / 10.1002 / ejlt.201300416.

Луччи П., Пачетти Д., Лоиццо М. Р. и Фрега Н. Г. (2015). Пуница

granatum cv. Этанольный экстракт семян Dente di Cavallo: антиоксидант

и антипролиферативная активность. Пищевая химия, 167, 475-483. http: //

dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.06.123.PMid: 25149014.

Манчини-Филхо, Дж., Такемото, Э., и Ауед-Пиментель, С. (2015). Parâmetros

de Identidade e qualidade de óleos e gorduras. В: L. B. Almeida —

Muradian & M. D. V. C. Penteado (Eds.), Ciências farmacêuticas

— vigilância sanitária — tópicos sobre законодательство e análise de alimentos

(2-е изд. 682), гл. Рио-де-Жанейро: Гуарабара Куган.

Мекни, М., Диби, М., Харруби, В., и Хмида, Р. Б. (2014).Природные

конъюгированные и трансжирные кислоты в маслах семян и фитохимических веществах

в экстрактах семян трех тунисских сортов граната (Punica

granatum L.). Международный журнал современной микробиологии

и прикладных наук, 3 (8), 778-792.

Мело, И. Л. П., Карвалью, Э. Б. Т., и Манчини-Филью, Дж. (2014). Масло семян граната

(Punica granatum L.): источник пунической кислоты (конъюгированная

α-линоленовая кислота).Журнал питания человека и науки о продуктах питания, 2, 1-11.

Мендес, Э., Сануэза, Дж., Спейски, Х., и Ва-Ленсуэла, А. (1996). Валидация

теста Rancimat для оценки относительной стабильности рыбьего жира

. Журнал Американского общества химиков-нефтяников, 73 (8), 1033-1037.

http://dx.doi.org/10.1007/BF02523412.

Ненадис, Н., Ван, Л. Ф., Цимиду, М., и Чжан, Х. Ю. (2004). E стимуляция

активности по улавливанию фенольных соединений с использованием, скажем, ABTS • +

.Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии, 52 (15), 4669-4674.

http://dx.doi.org/10.1021/jf0400056. PMid: 15264898.

Ням, К. Л., Тан, К. П., Лай, О. М., Лонг, К., и Ман, Ю. Б. С. (2009).

Физико-химические свойства и биологически активные соединения выбранных масел из семян

. Lebensmittel-Wissenscha + Technologie, 42 (8), 1396-1403.

http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2009.03.006.

Pal, M., & Ghosh, M. (2012). Исследования сравнительной эффективности α-линоленовой кислоты

и α-элеостеариновой кислоты в профилактике окислительного стресса, вызванного органической ртутью

, в почках и печени крыс.Продукты питания и

Химическая токсикология, 50 (3-4), 1066-1072. http://dx.doi.org/10.1016/j.

fct.2011.12.042. PMid: 22269903.

Панде, Г., & Ако, К. С. (2009). Антиоксидантная способность и липид

характеристика шести сортов граната, выращенных в Джорджии. Журнал

сельскохозяйственной и пищевой химии, 57 (20), 9427-9436. http: //dx.doi.

org / 10.1021 / jf

0p. PMid: 19743855.

Парашар А., Синха Н. и Сингх П. (2010). Содержание липидов и жирных кислот

Состав масла из семян двадцати пяти сортов гранатов, выращиваемых

в Индии.Advanced Journal of Food Science and Technology, 2, 12-15.

Преша, А., Грайзер, М., Дедык, М., и Граета, Х. (2014). Антиоксидантная активность и окислительная стабильность масел холодного прессования

. Журнал

Американского общества химиков-нефтяников, 91 (8), 1291-1301. http: //dx.doi.

org / 10.1007 / s11746-014-2479-1. PMid: 25076788.

Прайор, Р. Л., Хоанг, Х., Гу, Л., Ву, X., Баккиокка, М., Ховард, Л.,

Хэмпш-Вудилл, М., Хуанг, Д., Оу, Б., И Джейкоб Р. (2003). Анализ

на гидрофильную и липофильную антиоксидантную способность (абсорбционная способность кислородных радикалов

(ORACFL)) плазмы и других биологических образцов и

образцов пищевых продуктов. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии, 51 (11),

3273-3279. http://dx.doi.org/10.1021/jf0262256. PMid: 12744654.

Рибейро, М. К., Вилас Боас, Э. В. Б., Риул, Т. Р., Пантойя, Л., Мариньо,

Х. А., и Сантос, А. С. (2012). Влияние метода экстракции

и времени хранения на физико-химические свойства и уровни каротиноидов

пекви (Caryocar brasiliense Camb.) масло. Наука о продуктах питания и

Technology (Кампинас), 32 (2), 386-392. http://dx.doi.org/10.1590/

S0101-20612012005000053.

Раджастан, Индия. Международный журнал фундаментальной и прикладной химии

Sciences, 2, 59-62.

Аруна П., Венкатараманамма Д., Сингх А. К. и Сингх Р. П.

(2016). Польза пуниновой кислоты для здоровья: обзор. Всесторонние обзоры

в Науке о продуктах питания и безопасности пищевых продуктов, 15 (1), 16-27. http: //dx.doi.

орг / 10.1111 / 1541-4337.12171.

Боблитс, Р. Т., Полман, Ф. У., Браун, Х. мл., Джонсон, З. Б., Проктор,

А., Сойер, Дж., Диас-Морс, П., и Галлоуэй, Д. Л. (2007). Инъекция конъюгированной линолевой кислоты

в филе говядины. Meat Science, 75 (1), 84-

93. http://dx.doi.org/10.1016/j.meatsci.2006.07.006. PMid: 22063415.

Блуа, М.С. (1958). Определение антиоксидантов с использованием стабильного свободного радикала

. Природа, 181 (4617), 1199-1200.http: //dx.doi.

org / 10.1038 / 1811199a0.

Калиджани А., Бонзанини Ф., Палла Дж., Чирлини М. и Бруни Р. (2010).

Характеристика потенциального нутрицевтического ингредиента: неомыляемая фракция масла семян граната

(Punica granatum L.). Plant Foods

for Human Nutrition (Дордрехт, Нидерланды), 65 (3), 277-283. http: //

dx.doi.org/10.1007/s11130-010-0173-5. PMid: 20607413.

Карвалью, Э. Б. Т., Мело, И. Л.П., и Манчини-Филхо, Дж. (2010). Химический

и физиологические аспекты изомеров конъюгированных жирных кислот. Продовольствие

Наука и технологии (Кампинас), 30 (2), 295-307. http: //dx.doi.

орг / 10.1590 / S0101-20612010000200002.

Киринос, Р., Зулоэта, Г., Педрески, Р., Миньоле, Э., Ларонделл, Ю.,

и Кампос, Д. (2013). Саша инчи (Plukenetia volubilis): семя

, источник полиненасыщенных жирных кислот, токоферолов, фитостеринов, фенольных соединений

и антиоксидантной способности.Пищевая химия,

141 (3), 1732-1739. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.04.078.

PMid: 23870885.

Christie, W. W., Sébédio, J. L., & Juanéda, P. (2001). Практическое руководство

к анализу конъюгированной линолевой кислоты. Информ (Сильвер Спринг,

мкр.), 12, 147-152.

Комиссия Codex Alimentarius — CODEX. (1999). Codex stan

210-1999: стандарт Codex для названных растительных масел. Получено с:

http: // www.codexalimentarius.org/input/download/standards/336/

CXS_210e.pdf

Fernandes, L., Pereira, JA, Lopé z-Cortés, I., Salazar, DM, Ramalhosa,

E., & Casal, С. (2015). Состав жирных кислот, витамина Е и стеринов

масел из семян девяти различных сортов граната (Punica granatum L.)

сортов, выращенных в Испании. Журнал пищевого состава и анализа,

39, 13-22. http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2014.11.006.

Хабибния, М., Гавами, М., Ансарипур, М., и Восоу, С. (2012).

Химическая оценка масел, извлеченных из пяти различных сортов

семян иранского граната. Journal of Food Biosciences and

Technolog y, 2, 35-49.

Хабихт, С. Д., Кинд, В., Рудлофф, С., Борщ, К., Мюллер, А. С., Паллауф, Дж.,

Янг, Р., и Кравинкель, М. Б. (2011). Количественное определение антидиабетических экстрактов и соединений

в сортах горькой тыквы. Пищевая химия,

126 (1), 172-176.http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2010.10.094.

Хеннесси А., Росс Р. П., Дэвери Р. и Стэнтон К. (2011). Здоровье

способствует свойствам конъюгированных изомеров α-линоленовой кислоты.

Липиды, 46 (2), 105-119. http://dx.doi.org/10.1007/s11745-010-3501-

5. PMid: 21161605.

Цзин, П., Е, Т., Ши, Х., Шэн, Ю., Славин, М., Гао, Б., Лю, Л., и Ю, Л.

(2012). Антиоксидантные свойства и фитохимический состав

семян граната, выращенного в Китае.Пищевая химия, 132 (3), 1457-1464.

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.12.002. PMid: 236.

Ходдами, А., Ман, Ю. Б. К., и Робертс, Т. Х.