| Название травы | Уровень персонажа | Квадрат на карте Мира | Координаты на карте | Картинка ресурса | Картинка ресурса |
| Агератум | 1 | кв. 2, кв. 8, кв. 14, кв. 20 | 199 566; 200 420; 202 472; 205 543; 210 458; 211 354; 212 380; 213 445; 213 482; 215 617; 217 306; 222 597; 224 432; 225 686; 225 482; 226 448; 228 355; 228 465; 233 630; 238 492; 240 400; 243 508; 246 314; 246 630; 252 588; 253 460; 255 431; 258 691; 264 610; 267 666 | ||
| Безоар | 40 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 19, кв. 27, кв. 33 | 99 577; 99 526; 100 667; 114 634; 135 545; 136 653; 138 574; 147 691; 167 554; 181 675; 181 651; 187 581; 302 728; 321 763; 303 847; 310 778; 312 817; 326 899; 343 734; 354 772; 359 716; 362 819; 364 870; 370 860; 366 816; 383 824; 405 305; 411 339; 412 363; 419 404; | ||
| Белая слива | 80 | — | Земли магов и демонов: 331 518; 338 503; 340 623; 352 588; 353 607; 361 629; 368 596; 370 501; 373 486; 380 508; 385 502; 393 622; 418 589 Земли небожителей: 321 601; 333 580; 337 479; 342 461; 343 499; 344 608; 347 581; 356 513; 362 591; 371 558; 372 599; 372 540; 374 576; 376 628; 381 613; 393 536; 410 612 | — | |
| Белена | 40 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 19, кв. 27, кв. 33 | 99 577; 99 526; 100 667; 114 634; 135 545; 136 653; 138 574; 147 691; 167 554; 181 675; 181 651; 187 581; 302 728; 303 847; 310 778; 312 817; 317 762; 322 762; 326 899; 343 734; 354 772; 359 716; 362 819; 364 870; 368 864; 383 831; 405 305; 411 339; 412 363; 419 404; 423 320; 432 306 | ||
| Бузина | 20 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 16, кв. 19, кв. 22, кв. 27, кв. 28, кв. 33 | 102 694; 110 552; 112 574; 117 614; 118 526; 155 607; 155 595; 170 684; 315 880; 318 798; 324 795; 327 711; 334 816; 343 811; 343 813; 364 894; 365 848; 379 730; 382 776; 402 651; 404 481; 405 723; 418 564; 429 756; 430 632; 433 472; 436 561; 436 385; 437 696; 441 528; 443 517; 445 551; 446 505 | ||
| Водный каштан | 20 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 16, кв. 19, кв. 22, кв. 27, кв. 28, кв. 33 | 102 694; 110 552; 112 574; 117 614; 118 526; 155 607; 155 595; 170 684; 315 880; 318 798; 327 711; 336 814; 343 813; 364 894; 365 848; 379 730; 382 776; 402 651; 404 481; 405 723; 418 564; 429 756; 430 632; 433 472; 441 528; 443 517; 445 551; 446 505 | ||
| Древесная бабочка | 60 | кв. 1, кв. 7, кв. 31, кв. 37 | 97 845; 98 381;100 347; 101 998; 102 947; 102 920; 103 874; 107 817; 110 425; 110 325; 115 900; 116 404; 119 346; 121 830; 123 956; 124 327; 131 466; 140 974; 140 346; 140 425; 143 305; 154 1003;156 306;156 428; 156 476; 157 873; 159 346; 160 977; 164 822; 172 851 | ||
| Жасминный апельсин | 80 | — | Земли магов и демонов: 331 518; 338 503; 340 623; 352 588; 353 607; 361 629; 368 596; 370 501; 373 486; 380 508; 385 502; 393 622; 418 589 Земли небожителей: 321 601; 333 580; 337 479; 342 461; 343 499; 344 608; 347 581; 356 513; 362 591; 371 558; 372 599; 372 540; 374 576; 376 628; 381 613; 393 536; 410 612 | — | |
| Жук Девяти ароматов | 80 | — | Земли магов и демонов: 331 518; 338 503; 340 623; 352 588; 353 607; 361 629; 368 596; 370 501; 373 486; 380 508; 385 502; 393 622; 418 589 Земли небожителей: 321 601; 333 580; 337 479; 342 461; 343 499; 344 608; 347 581; 356 513; 362 591; 371 558; 372 599; 372 540; 374 576; 376 628; 381 613; 393 536; 410 612 | — | |
| Зеленая слива | 40 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 19, кв. 27, кв. 33 | 99 577; 99 526;100 667; 114 634; 135 545; 136 653; 138 574; 147 691; 167 554; 181 675; 181 651; 187 581; 302 728; 303 847; 304 851; 310 778; 312 817; 317 762; 320 761; 326 899; 343 734; 354 772; 359 716; 358 813; 362 819; 364 870; 383 831; 405 305; 411 339; 412 363; | ||
| Змеиная трава | 40 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 19, кв. 27, кв. 33 | 99 577; 99 526; 100 667; 114 634; 135 545; 136 653; 138 574; 147 691; 167 554; 181 675; 181 651; 187 581; 302 728; 303 847; 310 778; 312 817; 317 762; 326 899; 343 734; 354 772; 359 716; 362 819; 364 815; 364 870; 368 864; 383 831; 329 901; 405 305; 411 339; 412 363; 419 404; 423 320; 432 306 | ||
| Конский каштан | 20 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 16, кв. 19, кв. 22, кв. 27, кв. 28, кв. 33 | 102 694; 110 552; 112 574; 117 614; 118 526; 155 607; 155 595; 170 684; 315 880; 318 798; 322 794; 327 711; 343 813; 364 894; 365 848; 379 730; 382 776; 402 651; 404 481; 405 723; 418 564; 429 756; 430 632; 433 472; 436 561; 436 385; 437 696; 441 528; 443 517; 445 551; 446 505 | ||
| Красная слива | 60 | кв. 1, кв. 7, кв. 31, кв. 37 | 97 845; 98 381; 100 347; 101 998; 102 947; 102 920; 103 874; 107 817; 110 425; 110 325; 115 900; 116 404; 117 829; 119 346; 121 830; 123 956; 124 327; 131 466; 140 974; 140 346; 140 425; 143 305; 154 1003; 156 306; 156 428; 156 476; 157 873; 159 346; 160 977; 163 821; 172 851 | ||
| Ми Сян | 20 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 16, кв. 19, кв. 22, кв. 27, кв. 28, кв. 33 | 102 694; 110 552; 112 574; 117 614; 118 526; 155 607; 155 595; 170 684; 315 880; 318 798; 327 711; 335 812; 343 813; 364 894; 365 848; 379 730; 382 776; 402 651; 404 481; 405 723; 418 564; 429 756; 430 632; 433 472; 436 561; 436 385; 437 696; 441 528; 443 517; 445 551; | ||
| Молочай | 1 | кв. 2, кв. 8, кв. 14, кв. 20 | 199 566; 200 420; 202 472; 205 543; 210 458; 211 354; 212 380; 213 445; 213 482; 215 617; 217 306; 222 597; 224 432; 225 686; 225 482; 226 448; 228 355; 228 465; 233 630; 238 492; 240 400; 243 508; 246 314; 246 630; 252 588; 253 460; 255 431; 258 691; 264 610; 267 666 | ||
| Мышьяк | 20 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 16, кв. 19, кв. 22, кв. 27, кв. 28, кв. 33 | 102 694; 110 552; 112 574; 117 614; 118 526; 155 607; 155 595; 170 684; 315 880; 318 798; 323 793; 327 711; 338 812; 343 813; 364 894; 365 848; 379 730; 382 776; 402 651; 404 481; 405 723; 418 564; 429 756; 430 632; 433 472; 436 561; 436 385; 437 696; 441 528; 443 517; 445 551; 446 505 | ||
| Нектар | 1 | кв. 2, кв. 8, кв. 14, кв. 20 | 199 566; 200 420; 202 472; 205 543; 210 458; 211 354; 212 380; 213 445; 213 482; 215 617; 217 306; 222 597; 224 432; 225 686; 225 482; 226 448; 228 355; 228 465; 233 630; 238 492; 240 400; 243 508; 246 314; 246 630; 252 588; 253 460; 255 431; 258 691; 264 610; 267 666 | ||
| Орлиное дерево | 40 | кв. 13, кв. 19, кв. 27, кв. 32, кв. 33 | 99 577; 99 526; 100 667; 114 634; 135 545; 136 653; 138 574; 147 691; 167 554; 181 675; 181 651; 187 581; 201 814; 204 868; 214 834; 224 880; 235 813; 237 860; 241 832; 257 835; 264 819; 286 844; 302 728; 303 847; 310 778; 312 817; 317 762; 319 762; 326 899; 343 734; 354 772; 369 861; 387 829 | ||
| Палочник | 60 | кв. 1, кв. 7, кв. 31, кв. 37 | 97 845; 98 381;100 347; 101 998; 102 947; 102 920; 103 874; 107 817; 110 425; 110 325; 115 900; 116 404; 119 346; 121 830; 123 956; 124 327; 131 466; 140 974; 140 346; 140 425; 143 305; 154 1003;156 306;156 428; 156 476; 157 873; 159 346; 159 818; 160 977; 163 821; 172 851 | ||
| Пьянящая роса бессмертия | 60 | кв. 1, кв. 7, кв. 31, кв. 37 | 97 845; 98 381;100 347; 101 998; 102 947; 102 920; 103 874; 107 817; 110 425; 110 325; 115 900; 116 404; 118 826; 119 346; 121 830; 123 956; 124 327; 131 466; 140 974; 140 346; 140 425; 143 305;154 1003;156 306; 156 428; 156 476; 157 873; 159 346; 160 977; 163 821; 172 851 | ||
| Репейник | 20 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 19, кв. 22, кв. 27, кв. 28, кв. 33 | 102 694; 110 552; 112 574; 117 614; 118 526; 155 607; 155 595; 170 684; 315 880; 318 798; 327 711; 335 812; 343 813; 364 894; 365 848; 379 730; 382 776; 402 651; 404 481; 405 723; 429 756; 430 632; 433 472; 436 385; 437 696; 451 675; 453 793; 456 385; 463 699; 474 732; 475 471 | ||
| Темно-синяя мазь | 40 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 19, кв. 27, кв. 33 | 99 577; 99 526; 100 667; 114 634; 135 545; 136 653; 138 574; 147 691; 167 554; 181 675; 181 651; 187 581; 302 728; 302 844; 303 847; 310 778; 312 817; 317 762; 326 899; 343 734; 354 772; 359 716; 361 816; 362 819; 364 870; 383 831; 384 827; 405 305; 411 339; 412 363; 419 404; 423 320; 432 306 | ||
| Трава картежника | 80 | — | Земли магов и демонов: 352 588; 353 607; 361 629; 368 596; 370 501; 373 486; 380 508; 385 502; 393 622; 418 589 Земли небожителей: 321 601; 333 580; 337 479; 342 461; 343 499; 344 608; 347 581; 356 513; 362 591; 371 558; 372 599; 372 540; 374 576; 376 628; 381 613; 393 536; 410 612 | — | |
| Трава Призраков | 20 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 16, кв. 19, кв. 22, кв. 27, кв. 28, кв. 33 | 102 694; 110 552; 112 574; 117 614; 118 526; 155 607; 155 595; 170 684; 315 880; 318 798; 327 711; 335 814; 343 813; 360 853; 364 894; 365 848; 379 730; 382 776; 402 651; 404 481; 405 723; 418 564; 429 756; 430 632; 433 472; 436 561; 436 385; 437 696; 441 528; 443 517; 445 551; 446 505 | ||
| Трава Тигровый глаз (Трава тигрового уха) | 60 | кв. 1, кв. 7, кв. 31, кв. 37 | 97 845; 98 381; 100 347; 101 998; 102 947; 102 920; 103 874; 107 817; 110 425; 110 325; 115 900; 116 404; 119 346; 121 830; 123 956; 124 327; 131 466; 140 974; 140 346; 140 425; 143 305; 154 1003;156 306;156 428; 156 476; 157 873; 159 346; 160 977; 163 821; 167 819; 172 851 | ||
| Трава Эмменагога | 1 | кв. 2, кв. 8, кв. 14, кв. 20 | 199 566; 200 420; 202 472; 205 543; 210 458; 211 354; 212 380; 213 445; 213 482; 215 617; 217 306; 222 597; 224 432; 225 686; 225 482; 226 448; 228 355; 228 465; 233 630; 238 492; 240 400; 243 508; 246 314; 246 630; 252 588; 253 460; 255 431; 258 691; 264 610; 267 666 | ||
| Тюльпан | 60 | кв. 1, кв. 7, кв. 31, кв. 37 | 97 845; 98 381; 100 347; 101 998; 102 947; 102 920; 103 874; 107 817; 110 425; 110 325; 115 900; 116 404; 119 346; 121 830; 123 956; 124 327; 131 466; 140 974; 140 346; 140 425; 143 305; 154 1003;156 306;156 428; 156 476; 157 873; 159 346; 160 977; 163 821; 167 818; 172 851 | ||
| Шоу У | 40 | кв. 4, кв. 10, кв. 13, кв. 19, кв. 27, кв. 33 | 99 577; 99 526; 100 667; 114 634; 135 545; 136 653; 138 574; 147 691; 167 554; 181 675; 181 651; 187 581; 302 728; 303 847; 310 778; 312 817; 317 762; 321 760; 326 899; 343 734; 354 772; 359 716; 362 819; 364 870; 368 816; 381 835; 383 831; 405 305; 411 339; 412 363; 419 404; 423 320; 432 306 | ||
| Эссенция Просвещения | 80 | — | Земли магов и демонов: 331 518; 338 503; 340 623; 352 588; 353 607; 361 629; 368 596; 370 501; 373 486; 380 508; 385 502; 393 622; 418 589 Земли небожителей: 321 601; 333 580; 337 479; 342 461; 343 499; 344 608; 347 581; 356 513; 362 591; 371 558; 372 599; 372 540; 374 576; 376 628; 381 613; 393 536; 410 612 | — |
Конский — переводы, синонимы, грамматика, статистика
Словарь
английский
Переводы
horsy, equine
Словарь
испанский
Переводы
caballo, caballos, del caballo, caballo de, de caballos
Словарь
немецкий
Переводы
pferdeartig
Словарь
французский
Переводы
chevalin, hippique
Словарь
итальянский
Переводы
cavallo, horse, a cavallo, cavallo di, del cavallo
Словарь
португальский
Переводы
cavalo, do cavalo, cavalos, cavalo de, horse
Словарь
нидерландский
Переводы
paard, paarden, horse, het paard, paard van
Словарь
норвежский
Переводы
hest, Horse, hesten, heste, hestens
Словарь
шведский
Переводы
häst, hästen, horse, hästens
Словарь
финский
Переводы
hevonen, hevosen, horse, hevosta, hevosten
Словарь
датский
Переводы
hest, hesten, heste, horse, hestens
Словарь
чешский
Переводы
koňský
Словарь
польский
Переводы
koński, wyścigowy
Словарь
венгерский
Переводы
ló, lovat, lovas, horse, a ló
Словарь
турецкий
Переводы
at, Horse, atı, ATI, atın
Словарь
греческий
Переводы
άλογο, αλόγου, ίππων, αλόγων, των ίππων
Словарь
украинский
Переводы
кінський
Словарь
албанский
Переводы
kalë, kali, kuaj, kalë i, në kalë
Словарь
болгарский
Переводы
коне, еднокопитни
Словарь
белорусский
Переводы
конскі, конскае, вялізны конскі, дварэ конскі, на дварэ конскі
Словарь
эстонский
Переводы
hobusetaoline, hobusearmastaja
Словарь
хорватский
Словарь
исландский
Переводы
hestur, hesturinn, hestinn, hest, hesta
Словарь
литовский
Переводы
arklys, Horse, Jodinėjimas, arklių, žirgų
Словарь
латышский
Переводы
zirgs, Zirgu, horse, zirga, Izjādes ar
Словарь
македонский
Переводы
коњ, коњот, коњска, коњи, Закон
Словарь
румынский
Переводы
cal, cai, calul, de cai, de cal
Словарь
словенский
Переводы
konj, horse, konja, konjske, Konjska
Словарь
словацкий
Переводы
kôň, horse
Зеленая слива пв
| Название | Уровень | Уровень Игрока | Предмет | Необходим квест |
|---|---|---|---|---|
| Нектар | 1 | 1 | Нектар | — |
| Шалфей | 1 | 1 | Шалфей | — |
| Агератум | 1 | 1 | Агератум | — |
| Молочай | 1 | 1 | Молочай | — |
| Трава Призраков | 2 | 20 | Трава Призраков | — |
| Бузина | 2 | 20 | Бузина | — |
| Ми Сян | 2 | 20 | Ми Сян | — |
| Мышьяк | 2 | 20 | Мышьяк | — |
| Конский каштан | 2 | 20 | Конский каштан | — |
| Водный каштан | 2 | 20 | Водный каштан | — |
| Репейник | 2 | 20 | Репейник | — |
| Белена | 3 | 40 | Белена | — |
| Шоу У | 3 | 40 | Шоу У | — |
| Зеленая слива | 3 | 40 | Зеленая слива | — |
| Орлиное дерево | 3 | 40 | Орлиное дерево | — |
| Темно-синяя мазь | 3 | 40 | Темно-синяя мазь | — |
| Змеиная трава | 3 | 40 | Змеиная трава | — |
| Безоар | 3 | 40 | Безоар | — |
| Тюльпан | 4 | 60 | Тюльпан | — |
| Пьянящая роса бессмертия | 4 | 60 | Пьянящая роса бессмертия | — |
| Древесная бабочка | 4 | 60 | Древесная бабочка | — |
| Трава тигрового уха | 4 | 60 | Трава тигрового уха | — |
| Красная слива | 4 | 60 | Красная слива | — |
| Палочник | 4 | 60 | Палочник | — |
| Белая слива | 5 | 80 | Белая слива | — |
| Жасминный апельсин | 5 | 80 | Жасминный апельсин | — |
| Жук Девяти ароматов | 5 | 80 | Жук Девяти ароматов | — |
| Эссенция просвещения | 5 | 80 | Эссенция просвещения | — |
| Трава картежника | 5 | 80 | Трава картежника | — |
www.
pwdatabase.com
| 1837 | Агератум | 0 | 0 | |
| 1835 | Безоар | 0 | 0 | |
| 1852 | Белая слива | 0 | 0 | |
| 1846 | Белена | 0 | 0 | |
| 1820 | Бузина | 0 | 0 | |
| 1831 | Водный каштан | 0 | 0 | |
| 1848 | Древесная бабочка | 0 | 0 | |
| 1841 | Жасминный апельсин | 0 | 0 | |
| 1855 | Жук Девяти ароматов | 0 | 0 | |
| 1850 | Зеленая слива | 0 | 0 | |
| 1826 | Змеиная трава | 0 | 0 | |
| 1845 | Конский каштан | 0 | 0 | |
| 1851 | Красная слива | 0 | 0 | |
| 1838 | Ми Сян | 0 | 0 | |
| 1844 | Молочай | 0 | 0 | |
| 1834 | Мышьяк | 0 | 0 | |
| 1830 | Нектар | 0 | 0 | |
| 1839 | Орлиное дерево | 0 | 0 | |
| 1854 | Палочник | 0 | 0 | |
| 1857 | Пьянящая роса бессмертия | 0 | 0 | |
| 1825 | Репейник | 0 | 0 | |
| 1821 | Темно-синяя мазь | 0 | 0 | |
| 1828 | Трава картежника | 0 | 0 | |
| 1824 | Трава Призраков | 0 | 0 | |
| 1827 | Трава тигрового уха | 0 | 0 | |
| 1840 | Тюльпан | 0 | 0 | |
| 1823 | Шалфей | 0 | 0 | |
| 1832 | Шоу У | 0 | 0 | |
| 1842 | Эссенция просвещения | 0 | 0 |
pwdb.
info
| # | Название | Уровень | Ранг/Уровень | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Ми Сян | 0 | 0 | |
| 2 | Пьянящая роса бессмертия | 0 | 0 | |
| 3 | Жук Девяти ароматов | 0 | 0 | |
| 4 | Палочник | 0 | 0 | |
| 5 | Белая слива | 0 | 0 | |
| 6 | Красная слива | 0 | 0 | |
| 7 | Зеленая слива | 0 | 0 | |
| 8 | Древесная бабочка | 0 | 0 | |
| 9 | Белена | 0 | 0 | |
| 10 | Конский каштан | 0 | 0 | |
| 11 | Молочай | 0 | 0 | |
| 12 | Эссенция просвещения | 0 | 0 | |
| 13 | Жасминный апельсин | 0 | 0 | |
| 14 | Тюльпан | 0 | 0 | |
| 15 | Орлиное дерево | 0 | 0 | |
| 16 | Бузина | 0 | 0 | |
| 17 | Агератум | 0 | 0 | |
| 18 | Безоар | 0 | 0 | |
| 19 | Мышьяк | 0 | 0 | |
| 20 | Шоу У | 0 | 0 | |
| 21 | Водный каштан | 0 | 0 | |
| 22 | Нектар | 0 | 0 | |
| 23 | Трава картежника | 0 | 0 | |
| 24 | Трава тигрового уха | 0 | 0 | |
| 25 | Змеиная трава | 0 | 0 | |
| 26 | Репейник | 0 | 0 | |
| 27 | Трава Призраков | 0 | 0 | |
| 28 | Шалфей | 0 | 0 | |
| 29 | Темно-синяя мазь | 0 | 0 |
www.
pwdatabase.com
| # | Название | Базовый шанс | Реальный шанс | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Мягкий мех | 23.6826% | 11.5284% | |
| 2 | Железный картридж 1 | 13.4079% | 6.709% | |
| 3 | Сильное исцеляющее зелье | 9.9318% | 5.0163% | |
| 4 | Дубленая шкура | 9.4644% | 4.7862% | |
| 5 | Отличная микстура бодрости | 6.8759% | 3.5015% | |
| 6 | Оранжевый нефрит | 2.6816% | 1.3811% | |
| 7 | Счастливый билет | 0.9751% | 0.5045% | |
| 8 | ☆Великие часы | 0.5819% | 0.3014% | |
| 9 | ☆Великие часы | 0.5431% | 0.2813% | |
| 10 | ☆Изумрудный перстень | 0. 4901% | 0.2539% | |
| 11 | ☆Кольцо из рога носорога | 0.4901% | 0.2539% | |
| 12 | ☆Изумрудный перстень | 0.4574% | 0.237% | |
| 13 | ☆Кольцо из рога носорога | 0.4574% | 0.237% | |
| 14 | ☆Шлем лейтенанта | 0.3325% | 0.1723% | |
| 15 | ☆Корона с перьями | 0.3325% | 0.1723% | |
| 16 | ☆Темно-синяя броня | 0.3142% | 0.1629% | |
| 17 | ☆Мантия мистика | 0.3142% | 0.1629% | |
| 18 | ☆Роскошная броня | 0.3142% | 0.1629% | |
| 19 | ☆Корона с перьями | 0.3104% | 0.1609% | |
| 20 | ☆Шлем лейтенанта | 0.3104% | 0.1609% | |
| 21 | ☆Роскошная броня | 0.2933% | 0. 152% | |
| 22 | ☆Мантия мистика | 0.2933% | 0.152% | |
| 23 | ☆Темно-синяя броня | 0.2933% | 0.152% | |
| # | Название | % | ||
| 1 | Счастливый билет | 6.2982% | ||
| 2 | ☆Нефритовый трилистник | 5.9024% | ||
| 3 | ☆Кинжалы горя | 5.9024% | ||
| 4 | Свиток 2 | 5.0386% | ||
| 5 | Свиток 1 | 5.0386% | ||
| 6 | Пилюля тыквоголовых | 3.1491% | ||
| 7 | ☆Чакрам мудреца | 2.4593% | ||
| 8 | ☆Жезл призрака | 2.4593% | ||
| 9 | ☆Меч небесного мастера | 2.4593% | ||
| 10 | ☆Посох проклятий | 2.4593% | ||
| 11 | Пилюля Тыквенная голова | 2.3618% | ||
| 12 | Таблетка Укун | 1. 5746% | ||
| 13 | ☆Шипастая булава | 1.4755% | ||
| 14 | ☆Парные золоченые секиры | 1.4755% | ||
| 15 | ☆Секира великого духа | 1.4755% | ||
| 16 | ☆Позолоченные молоты | 1.4755% | ||
| 17 | ☆Жемчужина темного огня | 1.2956% | ||
| 18 | ☆Шипы цветов | 1.2956% | ||
| 19 | Зеленая яшма 3 ур. | 1.2597% | ||
| 20 | Рубиновый камень 2 ур. | 1.2597% | ||
| 21 | Рубиновый камень 3 ур. | 1.2597% | ||
| 22 | Сапфировый камень 2 ур. | 1.2597% | ||
| 23 | Сапфировый камень 3 ур. | 1.2597% | ||
| 24 | Изумрудный камень 2 ур. | 1.2597% | ||
| 25 | Изумрудный камень 3 ур. | 1.2597% | ||
| 26 | Янтарный камень 2 ур. | 1.2597% | ||
| 27 | Топазовый камень 2 ур. | 1.2597% | ||
| 28 | Подлинник 2 | 1.2597% | ||
| 29 | Подлинник 1 | 1.2597% | ||
| 30 | Желтая яшма 3 ур. | 1.2597% | ||
| 31 | Желтая яшма 2 ур. | 1.2597% | ||
| 32 | Красная яшма 3 ур. | 1.2597% | ||
| 33 | Красная яшма 2 ур. | 1.2597% | ||
| 34 | Черная яшма 3 ур. | 1.2597% | ||
| 35 | Черная яшма 2 ур. | 1.2597% | ||
| 36 | Зеленая яшма 2 ур. | 1.2597% | ||
| 37 | Белая яшма 3 ур. | 1.2597% | ||
| 38 | Белая яшма 2 ур. | 1.2597% | ||
| 39 | Топазовый камень 3 ур. | 1.2597% | ||
| 40 | Янтарный камень 3 ур. | 1..jpg) 2597% | ||
| 41 | ☆Серебряные когти | 0.9838% | ||
| 42 | ☆Многозарядный арбалет | 0.9838% | ||
| 43 | ☆Праща молодого охотника | 0.9838% | ||
| 44 | ☆Железный лук | 0.9838% | ||
| 45 | ☆Лазурное лезвие | 0.9838% | ||
| 46 | ☆Обоюдоострые клинки | 0.9838% | ||
| 47 | ☆Змеиное копье | 0.9838% | ||
| 48 | ☆Кастеты из вороненой стали | 0.9838% | ||
| 49 | ☆Убийца всадников | 0.9838% | ||
| 50 | ☆Гусиный хвост | 0.9838% | ||
| 51 | ☆Парные мечи Инь Ян | 0.9838% | ||
| 52 | ☆Клинок сотни битв | 0.9838% | ||
| 53 | Таблетка Бацзе | 0.7873% | ||
| 54 | ☆Посох заклинателя | 0. 5398% | ||
| 55 | ☆Чакрам из благородной стали | 0.5398% | ||
| 56 | ☆Жезл из нефрита | 0.5398% | ||
| 57 | ☆Меч семи звезд | 0.5398% | ||
| 58 | ☆Парные широкие секиры | 0.3239% | ||
| 59 | ☆Цветочная секира | 0.3239% | ||
| 60 | ☆Молоты из яркой стали | 0.3239% | ||
| 61 | ☆Восьмиугольная булава | 0.3239% | ||
| 62 | ☆Стальные кастеты | 0.2160% | ||
| 63 | ☆Лук феникса | 0.2160% | ||
| 64 | ☆Летящая птица | 0.2160% | ||
| 65 | ☆Автоматический арбалет | 0.2160% | ||
| 66 | ☆Потайные когти | 0.2160% | ||
| 67 | ☆Стократно закаленный меч | 0.2160% | ||
| 68 | ☆Посох с медным навершием | 0. 2160% | ||
| 69 | ☆Простой гуань дао | 0.2160% | ||
| 70 | ☆Копье из плохого серебра | 0.2160% | ||
| 71 | ☆Парные клинки ‘Союзники’ | 0.2160% | ||
| 72 | ☆Скрепляющие небо | 0.2160% | ||
| 73 | ☆Призрачное лезвие | 0.2160% | ||
| 74 | Счастливый билет | 0.0525% |
www.pwdatabase.com
Кот цветов сливы — Мобы ПВ
Количество циклов подсчета падения предметов: 1Вероятность падения определенного числа предметов
0: 60.0966 %
1: 29.9275 %
2: 7.98069 %
3: 1.9952 %
Мягкий мех, шанс 23.68%
Мягкий мех, шанс 23.68%
Железный картридж 1, шанс 13.41%
Сильное исцеляющее зелье (20), шанс 9.93%
Дубленая шкура, шанс 9.46%
Отличная микстура бодрости (20), шанс 6.88%
Оранжевый нефрит, шанс 2.68%
Счастливый билет, шанс 0.
98%
☆Великие часы (18), шанс 0.58%
☆Великие часы (18), шанс 0.58%
☆Великие часы (18), шанс 0.54%
☆Кольцо из рога носорога (19), шанс 0.49%
☆Изумрудный перстень (19), шанс 0.49%
☆Изумрудный перстень (19), шанс 0.49%
☆Кольцо из рога носорога (19), шанс 0.49%
☆Изумрудный перстень (19), шанс 0.46%
☆Кольцо из рога носорога (19), шанс 0.46%
☆Шлем лейтенанта (21), шанс 0.33%
☆Шлем лейтенанта (21), шанс 0.33%
☆Корона с перьями (21), шанс 0.33%
☆Корона с перьями (21), шанс 0.33%
☆Темно-синяя броня (20), шанс 0.31%
☆Роскошная броня (20), шанс 0.31%
☆Мантия мистика (20), шанс 0.31%
☆Роскошная броня (20), шанс 0.31%
☆Темно-синяя броня (20), шанс 0.31%
☆Мантия мистика (20), шанс 0.31%
☆Корона с перьями (21), шанс 0.31%
☆Шлем лейтенанта (21), шанс 0.31%
☆Мантия мистика (20), шанс 0.
29%
☆Роскошная броня (20), шанс 0.29%
☆Темно-синяя броня (20), шанс 0.29%
pwdb.info
| # | Название | Базовый шанс | Реальный шанс | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Таблетка росы | 28.9949% | 12.1114% | |
| 2 | Сильная кислота | 22.9262% | 9.7331% | |
| 3 | Малое восстанавливающее зелье | 12.4798% | 5.4486% | |
| 4 | Малая микстура духа | 8.3199% | 3.6732% | |
| 5 | Синтетическое масло | 7.7652% | 3.4335% | |
| 6 | Железный картридж 2 | 6.3534% | 2.8199% | |
| 7 | Желтый нефрит | 2.5413% | 1.1396% | |
| 8 | Счастливый билет | 2.5413% | 1.1396% | |
| 9 | ☆Блестящий шлем | 0. 4697% | 0.2118% | |
| 10 | ☆Ледяная корона | 0.4697% | 0.2118% | |
| 11 | ☆Броня Страдание | 0.4368% | 0.197% | |
| 12 | ☆Кольчуга Дух льва | 0.4368% | 0.197% | |
| 13 | ☆Халат Духа Солнечного света | 0.4368% | 0.197% | |
| 14 | ☆Ожерелье чистого неба | 0.4310% | 0.1944% | |
| 15 | ☆Ожерелье из кости носорога | 0.4310% | 0.1944% | |
| 16 | ☆Ожерелье чистоты | 0.4310% | 0.1944% | |
| 17 | ☆Кровоостанавливающие наручи | 0.3102% | 0.1399% | |
| 18 | ☆Наручи призрака | 0.3102% | 0.1399% | |
| 19 | ☆Нарукавники падающего света | 0.3102% | 0.1399% | |
| 20 | ☆Кровоостанавливающие наручи | 0. 2895% | 0.1306% | |
| 21 | ☆Наручи призрака | 0.2895% | 0.1306% | |
| 22 | ☆Нарукавники падающего света | 0.2895% | 0.1306% | |
| 23 | ☆Ароматная сумка монаха | 0.2855% | 0.1288% | |
| 24 | ☆Изумрудная перевязь | 0.2855% | 0.1288% | |
| 25 | ☆Ремень пурпурного облака | 0.2855% | 0.1288% | |
| 26 | ☆Сапоги падающего света | 0.2793% | 0.126% | |
| 27 | ☆Сапоги призрака | 0.2793% | 0.126% | |
| 28 | ☆Ароматная сумка монаха | 0.2665% | 0.1202% | |
| 29 | ☆Изумрудная перевязь | 0.2665% | 0.1202% | |
| 30 | ☆Ремень пурпурного облака | 0.2665% | 0.1202% | |
| 31 | ☆Сапоги падающего света | 0. 2607% | 0.1176% | |
| 32 | ☆Сапоги призрака | 0.2607% | 0.1176% | |
| # | Название | % | ||
| 1 | Счастливый билет | 6.8077% | ||
| 2 | Кристалл дружбы | 6.8077% | ||
| 3 | Свиток 5 | 4.7654% | ||
| 4 | Свиток 6 | 4.7654% | ||
| 5 | ☆Кинжалы хаоса | 3.6308% | ||
| 6 | ☆Сапфир заклинателя | 3.6308% | ||
| 7 | Сведения о Бездушных 04 (1/2) | 2.7231% | ||
| 8 | Сведения о Бездушных 04 (2/2) | 2.7231% | ||
| 9 | Пилюля тыквоголовых | 2.1785% | ||
| 10 | Пилюля Тыквенная голова | 1.6339% | ||
| 11 | ☆Шипы мятежного сердца | 1.5561% | ||
| 12 | ☆Сфера духовной гармонии | 1. 5561% | ||
| 13 | ☆Меч Дзен | 1.5128% | ||
| 14 | ☆Жезл духовной гармонии | 1.5128% | ||
| 15 | ☆Боевой диск принца | 1.5128% | ||
| 16 | ☆Посох духовной защиты | 1.5128% | ||
| 17 | Рубиновый камень 2 ур. | 1.3615% | ||
| 18 | Рубиновый камень 3 ур. | 1.3615% | ||
| 19 | Сапфировый камень 2 ур. | 1.3615% | ||
| 20 | Сапфировый камень 3 ур. | 1.3615% | ||
| 21 | Изумрудный камень 2 ур. | 1.3615% | ||
| 22 | Изумрудный камень 3 ур. | 1.3615% | ||
| 23 | Янтарный камень 2 ур. | 1.3615% | ||
| 24 | Янтарный камень 3 ур. | 1.3615% | ||
| 25 | Топазовый камень 2 ур. | 1.3615% | ||
| 26 | Топазовый камень 3 ур. | 1.3615% | ||
| 27 | Белая яшма 2 ур. | 1.3615% | ||
| 28 | Белая яшма 3 ур. | 1.3615% | ||
| 29 | Зеленая яшма 2 ур. | 1.3615% | ||
| 30 | Зеленая яшма 3 ур. | 1.3615% | ||
| 31 | Черная яшма 2 ур. | 1.3615% | ||
| 32 | Черная яшма 3 ур. | 1.3615% | ||
| 33 | Красная яшма 2 ур. | 1.3615% | ||
| 34 | Красная яшма 3 ур. | 1.3615% | ||
| 35 | Желтая яшма 2 ур. | 1.3615% | ||
| 36 | Желтая яшма 3 ур. | 1.3615% | ||
| 37 | Подлинник 5 | 1.3615% | ||
| 38 | Подлинник 6 | 1.3615% | ||
| 39 | Таблетка Укун | 1.0892% | ||
| 40 | ☆Секиры смертельного удара | 0. 9077% | ||
| 41 | ☆Секира мрачных казематов | 0.9077% | ||
| 42 | ☆Сверкающие молоты | 0.9077% | ||
| 43 | ☆Кровавый клык | 0.9077% | ||
| 44 | Оракул 3 | 0.6808% | ||
| 45 | Оракул 4 | 0.6808% | ||
| 46 | ☆Арка света | 0.6484% | ||
| 47 | Жезл призыва духа | 0.6484% | ||
| 48 | ☆Чакрам демона | 0.6484% | ||
| 49 | ☆Посох Бодхи | 0.6484% | ||
| 50 | ☆Клюв Феникса | 0.6052% | ||
| 51 | ☆Закаленное копье | 0.6052% | ||
| 52 | ☆Матерый волк | 0.6052% | ||
| 53 | ☆Меч Аэрин | 0.6052% | ||
| 54 | ☆Парные мечи гармонии | 0.6052% | ||
| 55 | ☆Смерть полководца | 0. 6052% | ||
| 56 | ☆Парные клинки ‘Пила’ | 0.6052% | ||
| 57 | ☆Дробящие камень | 0.6052% | ||
| 58 | ☆Печать молчания | 0.6052% | ||
| 59 | ☆Пурпурный гриф | 0.6052% | ||
| 60 | ☆Орел | 0.6052% | ||
| 61 | ☆Облачная гряда | 0.6052% | ||
| 62 | Таблетка Бацзе | 0.5447% | ||
| 63 | ☆Рыбьи хвосты | 0.3890% | ||
| 64 | ☆Секира расколотой тверди | 0.3890% | ||
| 65 | ☆Кузнечные молоты | 0.3890% | ||
| 66 | ☆Ледокол | 0.3890% | ||
| 67 | ☆Парные мечи Кан Ли | 0.2594% | ||
| 68 | ☆Серебряная луна | 0.2594% | ||
| 69 | ☆Кристальный ручей | 0.2594% | ||
| 70 | ☆Душегуб | 0. 2594% | ||
| 71 | ☆Ледяной меч | 0.2594% | ||
| 72 | ☆Убийца легионов | 0.2594% | ||
| 73 | ☆Клинки полуденного солнца | 0.2594% | ||
| 74 | ☆Кулак огня | 0.2594% | ||
| 75 | ☆Цепь молний | 0.2594% | ||
| 76 | ☆Праща из бычьих жил | 0.2594% | ||
| 77 | ☆Осадный арбалет | 0.2594% | ||
| 78 | ☆Тусклая тень | 0.2594% | ||
| 79 | Счастливый билет | 0.0648% | ||
| 80 | Форма: капюшон демона | 0.0012% | ||
| 81 | Форма: клинок черной тени | 0.0005% |
www.pwdatabase.com
- Предметы
- Монстры
- NPC
- Ресурсы
- Квесты
- Гайды
- Новости (от 25.05.2017)
- Оружие
- Мечи
- Простой клинок
- Простой меч
- Парные мечи
- Парные клинки
- Копья
- Копье
- Алебарда
- Посох
- Дубина
- Топоры/Молоты
- Булава
- Длинная секира
- Парные секиры
- Парные булавы
- Оружие дальнего боя
- Лук
- Арбалет
- Праща
- Кастеты
- Железные кастеты
- Кастеты с лезвиями
- Срок годности
- Бич
- Гибкий кнут
- Цепная плеть
- Магическое оружие
- Меч мистика
- Короткий посох
- Чакрам
- Посох
- Кинжалы
- Особое испытание
- Кинжалы
- Магическая сфера
- Особое испытание
- Магическая сфера
- Сабля
- Коса
- Мечи
- Одежда
- Верх
- Тяжелая броня
- Легкая броня
- Мантия
- Низ
- Грубые бриджи
- Тонкие бриджи
- Штаны мистика
- Обувь
- Тяжелые ботинки
- Тонкие сапоги
- Сандалии
- Голова
- Капюшон мистика
- Тяжелый шлем
- Наручи
- Грубые наручи
- Браслеты
- Браслет
- Накидка
- Сборник цитат
- Испытание сборника цитат
- Сборник цитат
- Верх
- Бижутерия
- Ожерелье
- Пестрое ожерелье
- Ожерелье падающего света
- Красивое ожерелье
- Пояс
- Ремень
- Ароматная сумка
- Перевязь
- Кольцо
- Металлическое кольцо
- Драгоценное кольцо
- Ожерелье
- Зелья
- Восстанавливается ЖС
- Целебное зелье
- Восстанавливающий порошок
- Небесный порошок
- Награда за доставку
- Мероприятия 2008 года
- Задание Оружейного зала »Прика
- VIP-карта
- Восстанавливает МЭ
- Духовное зелье
- Живая вода
- Таблетка орлиного дерева
- Награда за доставку
- Задание Оружейного зала »Прика
- VIP-карта
- Восстанавливает ЖС и МЭ
- Девять солнц
- Порошок девяти драконов
- Серая амбра
- Награда за доставку
- Лекарство для поддержания сил
- Детоксикатор
- Мгновенное противоядие
- Восстанавливается ЖС
- Ингридиенты
- Знакомство с типами оружия
- Клинки и мечи
- Копья
- Секиры и булавы
- Кастеты
- Метательное оружие
- Магическое оружие
- Класс Бичей
- Медицинские материалы
- Восстанавливает ЖС (Основное)
- Восстанавливает ЖС (Улучшено)
- Восстанавливает ЖС (Полное)
- Восстанавливает МЭ (Основное)
- Восстанавливает МЭ (Улучшено)
- Восстанавливает МЭ (Полное)
- Восстанавливает ЖС и МЭ (осн.
) - Восстанавливает ЖС и МЭ (лучш.)
- Основные противоядия
- Улучшенное противоядие
- Улучшенные амулеты
- Ингредиенты для заклинаний
- Составляющие защитных чар
- Улучшенные магические материалы
- Улучшенные составляющие заслона
- Знакомство с типами брони
- Верх
- Низ
- Сапоги
- Наручи
- Голова
- Накидка
- Знакомство с украшениями
- Кольцо
- Ожерелье
- Пояс
- Знакомство с классами
- Красный нефрит
- Оранжевый нефрит
- Желтый нефрит
- Светло-зеленый нефрит
- Зеленый нефрит
- Синий нефрит
- Пурпурный нефрит
- Черный нефрит
- Основные материалы
- Дерево
- Металл
- Камень
- Ткань
- Топливо
- Клей
- Масло
- Кожа
- Вещества для фейерверков
- Вещества для фейерверков
- Карта заботы о животном
- Кукла замены
- Материал для летного снаряжения
- Вещь в себе
- Духовный
- Материалы для модного платья
- Ткань
- Краска
- Особые материалы
- Заменитель золота
- Золотая фольга
- Полуготовое оборудование
- Полуобработанный металл
- Полуобработанное дерево
- Полуобработанная ткань
- Предметы, для работы на рынке
- Активность внутри
- Стоимость события
- Стоимость награды
- Деньги дешевеют, цены падают
- Особые товары Ур. 1
- Особые товары ур.2
- Особые товары Ур.3
- Особые товары Ур.4
- Особые товары Ур.5
- Особые товары Ур.6
- Особые товары Ур.7
- Особые товары Ур.8
- Особые товары Ур.9
- Особые товары ур.10
- Особые товары Ур.
- Желтый материал
- Оружие
- Доспех
- Украшение
- Таинственный материал
- Дополнения к книге переработки
- Страница
- Прочее
- Новые материалы для производств
- Случайные материалы
- Материалы для роста репутации
- Производство оранжевого оружия
- Материалы для базы гильдии
- Ресурсы карты сокровищ
- Для Северной Америки
- Обычные материалы
- Форма для улучш.предмета 9 арми
- Форма для улучш.предм.с 15 хар.
- Премия за сражения 2012 г.
- Инструмент для камня медитации
- Изг. камня глубокой медитации
- Жетон Деревни новичков 2013
- Жетон Деревни новичков
- Материалы для производства 2015
- Материалы для оружия
- Материалы для брони
- Знакомство с типами оружия
- Знаки Атаки
- Улучшение силы атаки
- Улучшение магической силы
- Знаки Защиты
- Улучшение защиты
- Улучшение заслона
- Магические камни
- Физический класс
- Магический класс
- Скоростной класс
- Уровень ЖС
- Уровень МЭ
- Происхождение пяти элементов
- Разное
- Модные вещи
- Верх
- Низ
- Сапоги
- Нарядные туфли
- Наручи
- Головной убор
- Модный головной убор
- Оружие
- Красители
- Снаряжение джинов
- Испытание
- Испытание жемчужного снаряжения
- Четки Цзин Фу
- Магические карты
- Разрушение
- Уничтожение
- Долголетие
- Здоровье
- Тайна
- Загадка
- Свидетельства
- Руны
)
1- Поиск
- Уровень 0 — 9
- Уровень 10 — 19
- Уровень 20 — 29
- Уровень 30 — 39
- Уровень 40 — 49
- Уровень 50 — 59
- Уровень 60 — 69
- Уровень 70 — 79
- Уровень 80 — 89
- Уровень 90 — 99
- Уровень 100-149
- Уровень 150
- Поиск
- Уровень 0 — 9
- Уровень 10 — 19
- Уровень 20 — 29
- Уровень 30 — 39
- Уровень 40 — 49
- Уровень 50 — 59
- Уровень 60 — 69
- Уровень 70 — 79
- Уровень 80 — 89
- Уровень 90 — 99
- Уровень 100-149
- Уровень 150
- Система Рун
- Скиллы и руны
- Титулы
pwdb.
info
Офигенская зеленая слива Ренклод, притаившаяся у нас на участке
Представляете, сегодня мы обнаружили у нас на участке целых 4 дерева зеленого сорта сливы!!! Смешно, но правда – у себя же на участке не знали о существовании слив! Кому скажи, не поверят, как такое возможно. Дело в том, что эти сливы притаились за сараем, в таком невидном месте, и сегодня как-то ну совершенно случайно мы их обнаружили. Выросли они видать из косточки и сами размножились. Одно дерево уже большое, а остальные 3 маленькие, может первый или второй год плодоносят. И растут сами по себе, никто за ними не ухаживает, никто не опрыскивает! Все с ними отлично, не болеют. Ну да, есть в некоторых плодах червячки, но оно и неудивительно – червяки тоже не смогли устоять перед такой вкуснотищей невероятной.
Знаете, это самая вкусная слива, которую я вообще когда-либо пробовала! Раньше я думала, что вкуснее синей Венгерки (слива-чернослив ее еще называют) ничего не бывает, но нет – эта зеленая слива божественно вкусна, лучше всех слив! И это при том, что слива далеко не самый мой любимый фрукт.
Мы с Сережей ели эту зеленую вкуснятину и нам казалось в тот момент, что в жизни ничего вкуснее не бывает! Так всегда у нас бывает с каким-то на 100% вкусными фруктами.
Вовремя мы обнаружили эту сливу, т.к. она уже созрела, некоторые сливы даже попадали на землю. Я раньше вообще никогда не видела зеленых сортов слив и даже не знала, что такие существуют. Это очень густая слива, плотная и при этом как бы кремовая, как супергустой дуриан. Ух и ах!
Называется этот сорт сливы, оказывается, Ронглёт или Ренклод.
Ммммм!
Райское наслаждение!
А вот это самое место.
Глядите, там никто не пропалывает, ничего вообще не делает. Так и нужно — не вмешиваться в жизнь растения, и оно будет радовать вкуснейшими плодами.
Мини сливовое деревце, выросшее на крыльце.
Оно же.
Еще одно дерево, с другой стороны сарая.
Как видите, здесь только напрочь отсутствует прополка и уход.
=$postovoy?>
fruitarian.ru
Гистологическое исследование конского каштана на инфекцию, вызываемую Pseudomonas syringae pv. aesculi и неразрушающая термообработка для остановки прогрессирования заболевания
Abstract
С момента своего появления в Северо-Западной Европе в качестве патогена, поражающего стволы и ветви Aesculus spp. (конские каштаны) примерно десять лет назад Pseudomonas syringae pv. aesculi быстро зарекомендовал себя как основная угроза этим деревьям.Зараженные деревья демонстрируют обширный некроз флоэмы и камбия, который в конечном итоге может привести к их отмиранию. События после проникновения хозяина, приводящие к обширному некрозу, недостаточно документированы. В этой работе исследуется гистопатология этого взаимодействия, а термическая обработка исследуется как метод уничтожения бактерий, связанных с установленными инфекциями. Ранние реакции заживления ран A. hippocastanum как в отсутствие, так и в присутствии P.
s. пв. aesculi , включал лигнификацию клеточной стенки отдельным слоем клеток флоэмы и паренхимы коры.Позже те же клетки откладывают субериновые ламели, что позволяет предположить, что этот слой функционирует в отделении здоровых тканей от поврежденных. Однако при мониторинге проникновения бактерий его конструкция оказалась недостаточной для ограничения распространения патогенов. Микроскопическая оценка распространения бактерий in situ с использованием иммунной метки и GFP-метки P. s. пв. aesculi , выявили два отличительных типа бактериальной колонизации. Было обнаружено, что передний фронт поражений содержит плотно упакованные бактерии, в то время как в некротических областях находятся бактериальные агрегаты с разбросанными индивидуумами, заключенными во внеклеточный матрикс бактериального происхождения, содержащий альгинат.Эндофитная локализация и способность П. с. pv aesculi для создания защитной матрицы, что делает его труднодоступным для агентов контроля.
Чтобы обойти это, был разработан метод, основанный на селективной бактериальной летальности при 39 ° C, и успешно протестирован на саженцах A. hippocastanum , что доказало концепцию борьбы с этим заболеванием с помощью термической обработки. Это может быть применимо для лечения других язв деревьев, вызванных родственными фитопатогенами.
Образец цитирования: de Keijzer J, van den Broek LAM, Ketelaar T., van Lammeren AAM (2012) Гистологическое исследование инфекции конского каштана, вызванной Pseudomonas syringae pv. aesculi и неразрушающая термообработка для остановки прогрессирования заболевания. PLoS ONE 7 (7): e39604. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039604
Редактор: Чжэнгуан Чжан, Нанкинский сельскохозяйственный университет, Китай
Поступила: 2 ноября 2011 г .; Одобрена: 23 мая 2012 г .; Опубликован: 9 июля 2012 г.
Авторские права: © 2012 de Keijzer et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: A. A. M. van Lammeren при поддержке рабочей группы Aesculaap’s, финансируемой Министерством сельского хозяйства, природы и качества продуктов питания Нидерландов. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Введение
С последнего десятилетия некротические поражения / язвы с липким экссудацией наблюдаются на стволах и ветвях деревьев рода Aesculus , особенно на белом конском каштане ( A.
hippocastanum ). Эти симптомы обнаруживаются в Северо-Западной Европе, сообщения поступают из Бельгии [1], Германии [2], Великобритании [3] и Нидерландов [4]. Заболевание является тяжелым, у значительной части населения проявляются типичные симптомы кровотечения [4], [5]. Он проявляется на стволах и ветвях, где вызывает некроз тканей коры и кровотечение из сока янтарного цвета, который на более поздних стадиях становится черным (рис. 1а). Часто сосудистый камбий некротизируется, что приводит к нерегулярному вторичному росту.Когда некроз флоэмы обширен, жизнеспособность дерева снижается, и опоясывающие поражения в конечном итоге приводят к отмиранию.
Рисунок 1. Кровоточивость конского каштана и биогенез структурного барьера после ранения.
(A) Типичные симптомы P. syringae pv. aesculi связанное кровотечение, наблюдаемое на стволе дерева A. carnea , включая кровотечение из сока янтарного цвета и растрескивание коры (наконечники стрелок).
Фотография сделана в сентябре.2008 г. на с.ш. 51 ° 57 ′ 26 ″; E5 ° 34 ′ 10 ″. (B) Внешний вид поверхностных ран на проростках A. hippocastanum , имитирующих имитацию (верхняя панель) или инокулированных P. s. пв. aesculi PD5126 (нижняя панель) через 3 месяца. В то время как кора проростков восстанавливается при имитации инокулирования путем регенерации перидермы, раненая ткань выглядит почерневшей и впалой при инокулировании P. s. пв. летучие мыши . (C) Иммунофлуоресцентная маркировка поперечного среза области раны, взятого непосредственно после инокуляции P.с. пв. aesculi PD4818 (t = 0) указывает, что бактерии (зеленый цвет) колонизируют только самый внешний слой клеток после инокуляции. Масштабная шкала показывает 100 мкм. (D) Продольный срез имитационной инокулированной раны, взятой через 6 дней лигнином, окрашенным флороглюцином-HCl (красный / пурпурный). Вдоль раны видна барьерная зона, состоящая из нескольких одревесневших клеток паренхимы (стрелка), а также широкий слой диффузно одревесневших клеток в разъединенной части (стрелка).
Масштабная линейка показывает 0.5 мм. (E) Флуоресцентное микроскопическое наблюдение на продольном срезе раны, взятой через 8 дней после инокуляции PD4818, окрашенной на воск с использованием Судана IV. Клетки, которые демонстрируют лигнификацию, как видно по желто-зеленой автофлуоресценции, также демонстрируют окрашенные Суданом IV ламеллы суберина, которые выглядят тускло-красными. Стрелка отражает направление исходной посевной срезки. Шкала показывает 50 мкм. (F) Деталь E, показывающая равномерное отложение суберина вокруг протопластов растений. Масштабная линейка показывает 25 мкм.(G) Непрерывное отложение суберина двумя клетками на полях ям (стрелки). Масштабная линейка показывает 10 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039604.g001
Хотя известно, что Phytophthora вызывают симптомы кровотечения у конского каштана [6], эта недавняя вспышка неизменно связана с Gram- отрицательная бактерия Pseudomonas syringae [1] — [4]. Интересно, что новые европейские изоляты показали высокую степень генетического сходства с ранее описанным индийским P.
syringae pathovar, который вызывает пятнистость листьев у A. indica [7], и поэтому они были размещены в том же патоваре aesculi [2], [3], [8]. Действительно, внезапная вирулентность этого патогена конского каштана почти наверняка связана с его недавним прибытием в Европу, вероятно, занесенным из Индии незадолго до эпидемии в Северной Европе [8].
Европейский P. syringae pv. aesculi встречается как эпифит на листьях, цветках и плодах дерева-хозяина [9].Бактерия может вести эндофитный, патогенный образ жизни при наличии небольших ран, например рубцов на листьях или поверхностных повреждений, вызванных деятельностью человека [10], [11]. Было показано, что другие потенциальные точки входа для бактерии включают чечевицеобразные клетки [11], хотя инокуляция этих участков распылением была безуспешной даже в условиях вскрытия чечевиц [10]. Как только инфекция установлена, она может распространяться тангенциально (диффузно) или преимущественно в продольном направлении [10], [11].
В центре старых поражений бактерии не обнаруживаются или обнаруживаются небольшие количества, в отличие от их краев и свежих поражений [5]. Это указывает на активную колонизацию новых тканей хозяина, но точные пути распространения бактерий и места размножения неизвестны.
Поврежденная ткань растения может привести к высыханию и стать потенциальным местом проникновения патогенов. Поэтому для растений важно отделять здоровые ткани от поврежденных. Как правило, раны или места инфекции в коре деревьев могут быть закрыты образованием перидермы de novo (состоящей из феллем, феллогена и феллодермы), что считается неспецифической защитной реакцией [12].Наблюдалось формирование нового слоя перидермы около инфекционных дворов в коре Aesculus , но оказалось неэффективным в предотвращении (дальнейшей) бактериальной инвазии [4], [11]. Однако до разработки новой перидермы компоненты, укрепляющие клеточную стенку, откладываются существующими клетками возле ран у многих видов деревьев [13] — [16].
В этом контексте лигнин и суберин являются широко распространенными компонентами начального заживления ран и могут предотвращать потерю воды и дальнейшее разрушение тканей [13].Для конского каштана время и природа такого структурного усиления клеточной стенки в пограничной зоне раны не описаны, и его возможная роль в предотвращении развития кровотечения неизвестна.
Понимание поведения бактерий и их локализации в тканях конского каштана может дать представление о внезапной вирулентности этого нового патогена конского каштана и может иметь значение для понимания процесса заражения другими родственными патогенами. В этом исследовании ранний процесс заражения P.syringae pv. aesculi визуализируется в искусственно инокулированных проростках A. hippocastanum с использованием иммуногистохимии и конститутивной плазмидной экспрессии GFP. Ранний структурный защитный ответ охарактеризован с помощью различных гистохимических красителей, и оценена его связь с распространением бактерий.
Края поражения наблюдались для выявления потенциальных маршрутов миграции бактерий через ткани хозяина. Кроме того, исследуется подход, заключающийся в селективном контроле бактерий-возбудителей на основе тепла.
Результаты
Для исследования ранних событий после P. s. пв. aesculi вступает в контакт с внутренними тканями хозяина, бактерии наносили на небольшие ранки, нанесенные на стебли проростков A. hippocastanum . Метод ранения не вызвал непоправимых повреждений, так как имитация инокулированных ран показала образование новой перидермы, сливающейся с существующей, в течение 3 месяцев (рис. 1В, верхняя панель). Инокулированные раны такого выздоровления не показали (рис.1Б нижняя панель). Микроскопический анализ места инокуляции сразу после нанесения бактерий (t = 0) показал, что патоген колонизировал только разорванные клетки на поверхности раны (рис. 1C), гарантируя, что сам метод инокуляции не привел бактерии внутрь. более глубокие ткани.
Лигнин и Суберин откладываются у границы раны
Когда места инокуляции наблюдались под микроскопом, автофлуоресцентная выстилка, которая следовала за границами раны, последовательно определялась со второго или третьего дня после момента инокуляции и далее, как у имитации, так и у P.с. пв. aesculi инокулированных стеблей. Автофлуоресценция была ограничена клеточными стенками сплошного слоя клеток паренхимы, шириной в несколько клеток. Части выбранных временных точек окрашивали гистохимическими красителями для определения компонентов клеточной стенки, которые составляют наблюдаемую выстилку вблизи границы раны. Используя окрашивание флороглюцин-HCl, было определено, что локализация и время появления наблюдаемого слоя аутофлуоресцентных клеток соответствуют отчетливому внешнему виду лигнина (рис.1D). Распределение лигнина было ограничено несколькими клетками по внутреннему флангу раны (фиг. 1D, стрелка) и более диффузно распространялось в отделившейся части раны (фиг.
1D, стрелка). Часто клетки паренхимы, которые участвовали в пропитке лигнином, располагались на различном расстоянии от поверхности раны, предполагая, что сигнал передавался с поверхности раны на эти клетки. В целом, эти данные указывают на то, что лигнин является основным компонентом ранних реакций заживления ран у A.hippocastanum кора.
Помимо лигнина, другим гистологическим соединением с аутофлуоресцентными свойствами, которое потенциально может иметь значение для барьера, выстилающего рану, является суберин [13], [14], [17]. Чтобы одновременно визуализировать суберин и лигнин, срезы, окрашенные Суданом IV, наблюдали в условиях флуоресценции, после чего ламели суберина появлялись тускло-красным цветом, а автофлуоресценция лигнина не изменялась (см. Материалы и методы). С шестого дня после инокуляции и далее суберин обнаруживался в виде ламеллы на клеточной стенке клеток, ранее проявивших лигнификацию (рис.1E / F). Отложение было однородным и не перекрывало ямочные поля (рис. 1G), подтверждая, что выстилка из одревесневших и суберизованных клеток по периметру раны защищает рану от здоровых тканей. Не было обнаружено каких-либо существенных различий относительно времени и степени отложения суберина между P. syringae и имитацией инокулированных ран. Это указывает на то, что наблюдаемый слой клеток с одревесневшими и суберизованными стенками является внутренним ответом A. hippocastanum на ранение, которое также имеет место в присутствии P.с. пв. летучие мыши .
Первоначальная реакция растений не предотвращает распространение бактерий
Эффективность клеточного ответа в сдерживании инвазии патогенов после ранения может быть оценена в связи с наблюдениями за размножением бактерий. С помощью иммуномаркировки распространение инокулированных P. s. пв. Наблюдалось aesculi . В течение первых 2 дней после инокуляции бактерии все еще в основном локализовались на поверхности раны, при этом некоторые отдельные бактерии располагались на несколько слоев клеток глубже (данные не показаны).На четвертый день после инокуляции за развивающейся барьерной зоной было обнаружено несколько разрозненных бактерий. Эти первые признаки проникновения бактерий были четко различимы в образцах, взятых через 6 дней после инокуляции, в которых были обнаружены небольшие скопления бактериальных клеток в межклеточных пространствах клеток паренхимы, очевидно, внутрь от лигнифицированной и суберизованной выстилки (рис. 2А, стрелки). Помимо колонизации живых тканей, в трещине раны оставались скопления бактерий (рис. 2А, стрелки).
Рисунок 2. Процесс заражения P. syringae pv. aesculi и бактериальное поведение in planta .
Инфекционный процесс до 18 недель после инокуляции, визуализированный с помощью иммуноцитохимического мечения P. syringae pv. летучие мыши . Стрелки в A, C, K, L, M, N и P указывают продольное направление. Масштабные полосы указывают 100 мкм на всех микрофотографиях, кроме B и C, где указано 10 мкм. (A) Через шесть дней после инокуляции, когда выстилка из одревесневших и суберизованных клеток заметна, скопления бактерий наблюдаются в более глубоких тканях паренхимы (стрелки) с помощью иммунной метки.Кроме того, бактерии остаются в исходном посевном срезе (стрелки). Показанное изображение взято из продольного разреза. (B) Бактериальное накопление в клетке паренхимы коры, наблюдаемое в продольном срезе участка инфекции, взятого через 14 дней после инокуляции. Помимо большого скопления, в межклеточных пространствах разбросано несколько отдельных бактерий. (C) Продольный срез ткани флоэмы через 6 дней после инокуляции, показывающий украшение волокон коры на P. s. пв. aesculi , по-видимому, следуя вертикальной ориентации этих элементов.(D, E) Крупный план и микрофотография поперечного среза имитационного инокулированного участка на растении конского каштана через 7 недель после инокуляции. Звездочка указывает на место ранения во время инокуляции. (F, G, H) Закройте и поперечные срезы мест инокуляции через 15 недель после инокуляции. Обратите внимание на частичное восстановление развития вторичной ксилемы, несмотря на инфекцию. Звездочки указывают на место ранения во время инокуляции. (I, J) Поперечные срезы коры имитированного (I) и инфицированного (J) конского каштана через 12 дней после инокуляции.Обратите внимание на удаленные растительные клетки, заполненные бактериями в J. (K). Кластеры бактерий в продольном срезе ксилемы рядом с местом инокуляции, через 4 недели после инокуляции. (L – N) Продольные срезы области камбия с бактериями в межклеточных пространствах паренхимы флоэмы (L), лучевой паренхимы (M) и вдоль волокон флоэмы (N) через 3 недели после инокуляции. (O) П. с. пв. aesculi в межклеточных пространствах, наблюдаемых в поперечном срезе камбиальной зоны через 4 недели после инокуляции.(P) Бактерии, украшающие пучок волокон флоэмы, окруженный новообразованной перидермой (*) и дегенерирующей паренхимой через 4 недели после инокуляции. (Q) Бактерии колонизируют некротизированную ткань коры через 10 недель после инокуляции. (R-T) Поперечные срезы вольеров, окруженные перидермой, с бактериями ex planta через 4, 10 и 18 недель после инокуляции, соответственно.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039604.g002
В течение нескольких дней после того, как за гистологическим барьером были обнаружены первые скопления бактерий, первые эффекты болезни были видны на клеточном уровне.Было обнаружено, что отдельные клетки паренхимы удаляются и заменяются большим скоплением бактерий (рис. 2B). Другие, одиночные бактерии часто обнаруживались в межклеточных пространствах окружающих клеток. Через неделю после инокуляции бактерии также были обнаружены в камбиальной области, хотя признаки деструктивного характера в этой ткани еще не были зарегистрированы. Интересно, что бактерии были обнаружены распределенными вдоль волокон склеренхимы флоэмы, прилегающей к поверхности раны (рис. 2C).
Долгосрочное распространение бактерий
Бактериальное поведение дополнительно контролировали в течение 18 недель после инокуляции.В то время как фиктивные инокулированные растения демонстрировали заживление ран и продолжали вторичный рост в месте инокуляции в течение 15 недель, инфицированные растения демонстрировали снижение вторичного роста (рис. 2D – H) и некроз, который увеличивался в продольном направлении. Через двенадцать дней после инокуляции скопления бактерий все еще обнаруживались в удаленных клетках живой коры (см. Рис. 2 I и J), а через 2 и 3 недели после инокуляции бактерии наблюдались во флоэме рядом с камбием и, случайно, в корковом слое. ксилему, но исключительно в непосредственной близости от места посева (рис.2К).
Через три-четыре недели после инокуляции многие бактерии наблюдались в межклеточном пространстве паренхимы флоэмы (рис. 2L), лучевой паренхиме (рис. 2M), вокруг волокон флоэмы (рис. 2N) и между клетками флоэмы вблизи области камбия. (Рис. 20). Таким образом, межклеточное пространство может способствовать продольному и радиальному распространению бактерий. В качестве реакции на инфекцию волокна флоэмы, украшенные бактериями, часто были окружены перидермой (рис. 2P).
В образцах, взятых через 10 и 18 недель после инокуляции, бактерии были обнаружены по краям расширяющихся очагов поражения, ex planta в дегенерированной коре (рис.2Q), на открытой поверхности раневой области (рис. 2R) и в оградках некротической ткани, прилегающих к камбию, но окруженных перидермой (рис. 2S – T). Таким образом, в течение всего периода исследования бактерии были обнаружены как в дегенерированной, так и в все еще дегенерирующей ткани коры.
Экспрессия GFP в
aesculi PathovarЧтобы иметь возможность более точно изучить бактерии in planta и выявить возможное динамическое поведение, предлагается метод конститутивной экспрессии GFP в P.с. пв. aesculi . Для облегчения экспрессии GFP у ассоциированных с растениями грамотрицательных бактерий Bloemberg et al. [18] сконструировал плазмиду pMP4655, которая содержит ген, кодирующий eGFP, управляемый промотором lac (таблица 1). Функции репликации этой плазмиды происходят от стабильной плазмиды pVS1 Pseudomonas , известной своей высокой стабильностью в отсутствие давления отбора [19], которое требуется, когда бактерии связаны со своим хозяином.
Два шт. пв. Штаммы aesculi , использованные в этом исследовании (Таблица 1), оказались чрезвычайно устойчивыми к методам трансформации, способствующим физическому перемещению плазмидной ДНК через клеточную мембрану (то есть методам электропорации и теплового шока; данные не показаны). Кроме того, использование плазмидной ДНК, полученной из дефицитного по метилированию штамма E. coli GM119 (таблица 1), не повысило эффективность трансформации, как это было описано для других штаммов P. syringae [20].Поэтому был использован протокол тройной конъюгации с использованием карбенициллина в качестве селективного агента, способствующего росту P. syringae после конъюгации (подробности см. В материалах и методах).
Полученотрансконъюгантов для особей. пв. aesculi штаммов и плазмидная экспрессия GFP оказались адекватными для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Экспрессия GFP не оказывала значительного влияния на скорость роста при выращивании штаммов в LB (рис.S1). Плазмида стабильно сохранялась в течение по крайней мере 30 поколений при субкультивировании в среде без давления отбора антибиотиков, как сообщалось для этой плазмиды при сохранении в других хозяевах [18], [21]. Когда P. s. пв. aesculi Трансформант PD4818-pMP4655 инокулировали на стебли проростков A. hippocastanum , под перидермой образовывались типичные удлиненные некротические поражения (рис. 3А), в основном в камбии и флоэме (рис. 3В). Учитывая высокую стабильность плазмиды и сохраняющуюся вирулентность по отношению к A.hippocastanum , экспрессирующие GFP трансформанты считались полезными для точного повторного выделения и дальнейших исследований бактериальной локализации и поведения in situ .
Рисунок 3. Поведение GFP-экспрессирующих P. syringae in planta.
(A) Проросток A. hippocastanum , инокулированный штаммом PD4818-pMP4655, сфотографированный через 2 месяца, демонстрирует вертикальное расширение очага поражения (до 6 см в длину) и некроз тканей после удаления внешних тканей коры.Место инокуляции указано стрелкой. Обратите внимание на изгиб инфекции вокруг нижнего узла. Масштабная линейка показывает 1 см. (B) Вид сбоку продольно разделенного участка стебля инокулированного проростка PD4818-pMP4655, удаленного на 1-2 см от места инокуляции через 4 недели после инокуляции. Некроз и изменение цвета видны в области камбия и флоэмы. (C) Продольный разрез границы инфекции в ткани коры после инокуляции PD4818-pMP4655, взятой через 4 недели после инокуляции.Зона параболической формы с повышенной автофлуоресценцией клеточной стенки различима (стрелки) с P. s. пв. aesculi колония, расположенная на кончике инфицированной зоны, на расстоянии около 1 см от места посева. Область в рамке подробно показана на D. Масштабная шкала показывает 25 мкм. (D) Через 4 недели после инокуляции многочисленные бактерии скапливаются на переднем крае прогрессирующего поражения паренхимы. Наблюдаемые здесь бактерии относительно небольшие и плотно упакованы. Масштабная линейка показывает 10 мкм.(E) В некротической области рядом с первоначальным местом инокуляции обнаружено несколько скоплений бактерий, которые занимают полости, оставленные мертвыми клетками. Изображение получено из продольного среза инфекции 6-недельной давности. Масштабная линейка показывает 25 мкм. (F) Большой агрегат PD4818-pMP4655, расположенный в некротической ткани 4-недельного поражения. Отдельные бактерии располагались на некотором расстоянии друг от друга и не подвергались никакому типу подвижности. Масштабная линейка показывает 25 мкм. (G) Деталь кластера PD4818-pMP4655 в некротической ткани 4-недельной инфекции, подчеркивающая расстояние между отдельными бактериями.Масштабная линейка показывает 10 мкм. (H) Иммунодетекция PD4818 дикого типа в некротической ткани 10-недельной инфекции, показывающая пространственное расположение бактерий, подобное показанному на G. Масштабная линейка показывает 10 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039604.g003
P. syringae pv. aesculi встроено во внеклеточную матрицу in plantaПовреждения, образованные GFP-экспрессирующим PD4818, анализировали через 4 и 6 недель после инокуляции.Вертикальное распространение инфекции иногда наблюдалось в виде ряда клеток параболической формы, демонстрирующих повышенную флуоресценцию клеточной стенки, содержащих скопление небольших, плотно упакованных бактерий на кончике (рис. 3C / D). Особенно на границах некротической ткани размещалось множество бактерий. Сгруппированные бактерии занимали пустые клетки растений (рис. 3E), а большие скопления бактерий были обнаружены в пустотах в некротизированной ткани хозяина (рис. 3F). Отдельные бактерии в этих агрегатах находились на некотором расстоянии от своих соседей и, по-видимому, не совершали никаких движений, в том числе броуновских (рис.3G). Аналогичная картина распределения наблюдалась также в поражениях, образованных бактериями дикого типа, с использованием иммуномаркировки (фиг. 3H). Пространственное расположение и неподвижность этих бактерий предполагает, что образование слизистой матрицы происходит в тканях хозяина, что может играть роль в стратегии инфекции и / или выживания бактерий.
Чтобы выяснить, имеет ли матрикс бактериальное происхождение, P. s. пв. aesculi PD4818 выращивали аксенически в жидкой минимальной среде.Когда культуры, выращенные в этих условиях, анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии, наблюдались кластеры клеток, завернутые в фибриллярный матрикс, чего не наблюдалось при выращивании культур в условиях, богатых питательными веществами (рис. 4A). Повторение этих экспериментов с использованием производного штамма PD4818, экспрессирующего GFP, действительно выявило присутствие агрегатов бактериальных клеток размером примерно до 100 мкм среди популяции подвижных бактерий. Кластеры содержали как живые, так и мертвые бактерии.Анализ оптических сечений и ортогональных плоскостей по оси z выявил трехмерное расстояние между бактериями (рис. 4B). Клетки внутри кластера были полностью статичными, хотя некоторые особи на краю кластера иногда демонстрировали колебательные движения (рис. 4C). Эти данные подтверждают, что матрица, полученная из бактерий, действительно может заключать индивидов в наблюдаемые бактериальные агрегаты in planta .
Рисунок 4. Фибриллярный матрикс продуцировал in vitro с помощью P.syringae pv. aesculi охватывает скопления иммобилизованных бактерий.
(A) После инкубации в минимальной среде с помощью сканирующей электронной микроскопии наблюдается фибриллярный материал, покрывающий сгруппированные бактериальные клетки (левая панель). Такой материал не встречается после инкубации в LB, при этом вне клетки наблюдаются только полярные жгутики (правая панель). На вставках более подробно показаны бактериальные клетки и окружающий материал. Обратите внимание, что из-за полностью обезвоженного состояния образца представленное здесь изображение, вероятно, не отображает истинное пространственное расположение бактериального кластера.Масштабные линейки показывают 1 мкм. (B) Типичный кластер, наблюдаемый в культуре PD4818-pMP4655, выращенной в минимальной среде, визуализируемой конфокальной лазерной сканирующей микроскопией. Бактерии, экспрессирующие GFP, отображаются зеленым цветом, в то время как добавление йодида пропидия (PI) ярко окрашивает мертвых особей в красный цвет и приводит к легкому окрашиванию аморфного материала, окружающего бактерии в кластере. Нижняя и правая панели представляют собой рассчитанные изображения двух ортогональных плоскостей вдоль оси z, обозначенных темно-серыми стрелками.Светло-серые стрелки указывают положение оптической плоскости, показанной на верхней левой панели. Обратите внимание, что отдельные бактерии отделены от соседних клеток в трех измерениях. Масштабные линейки показывают 10 мкм. (C) Три кадра с 10-секундным интервалом, взятые из покадровой видеозаписи края кластера PD4818-pMP4655 (изображенного на DIC-изображении), были разным цветом закодированы и объединены, чтобы выявить смещение отдельных бактерий с течением времени. Несколько подвижных бактерий свободно перемещались слева, проявляясь одним цветом на объединенном изображении, в то время как бактерии внутри кластера оставались в фиксированном месте, что видно по их белому цвету на объединенном изображении.Кроме того, по краю скопления (стрелка) можно различить колебательные движения 2 бактерий, на что указывает небольшое изменение цвета. Масштабная линейка показывает 5 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039604.g004
Чтобы определить, какой тип экзополисахарида потенциально может способствовать наблюдаемой матрице, P. s. пв. aesculi выращивали на жидкой минимальной среде с дополнительным солевым стрессом в течение 2 дней. Анализ m- гидроксидифенила выявил присутствие уроновых кислот в экзополисахариде, полученном после солевого стресса (данные не показаны).Высокоэффективную анионообменную хроматографию (HPAEC) использовали для дальнейшей идентификации сахарного состава экзополисахарида. В стрессовых условиях типичные продукты разложения альгината (гулуроновая кислота и маннуроновая кислота) наблюдались в виде двух соседних пиков (рис. S2), хотя относительное присутствие гулуроновой кислоты ниже, чем наблюдаемое для альгината, полученного из бурых водорослей, используемых в качестве контроля. Принимая во внимание наличие этих двух пиков, можно сделать вывод, что альгинат был преобладающим полисахаридом во внеклеточном материале, продуцируемом P.с. пв. aesculi при солевом стрессе. Предыдущие исследования указывают на возможное дополнительное присутствие глюкуроновой кислоты [22], которая элюируется примерно в то же время, что и маннуроновая кислота. Кроме того, были идентифицированы рамноза и глюкоза, хотя и в более низких концентрациях, чем альгинат (рис. S2). Также присутствовали незначительные следы неидентифицированного сахара.
Альгинат часто вырабатывается патогенными растениями Pseudomonas spp. когда они связаны с их хозяином [23] — [25].Его секреция способствует удержанию воды и, как считается, способствует колонизации бактерий и развитию симптомов [26]. Способность П. с. пв. aesculi для продуцирования альгината дополнительно подтверждается наличием генов, связанных с его биосинтезом и его регуляцией, как было проверено in silico . Данные последовательности п.с. пв. aesculi штамм 2250 [8] показал, что этот штамм обладает полным репертуаром генов, кодирующих биосинтез альгината и регуляторных белков, близких к гомологии с генами P.с. пв. помидор DC3000 (Таблица S1). Более того, было обнаружено, что большинство генов, участвующих в биосинтезе, расположены в канонической структуре оперона биосинтеза альгината [27].
Термическая обработка как возможный метод борьбы с кровотечением из конского каштана
После того, как бактериальные язвы на деревьях возникли, их, как известно, трудно контролировать, в основном из-за того, что места размножения бактерий плохо доступны извне [28].Было высказано предположение, что в качестве метода инактивации патогена конского каштана во время его эндофитного образа жизни может оказаться адекватным высокотемпературная обработка. Первоначальные опыты с использованием жидких культур P. s. пв. aesculi указали, что 24-часовая инкубация при 39 ° C неизменно не давала культивируемых бактерий (данные не показаны). Затем, чтобы оценить осуществимость такого метода термообработки на месте , выживаемость П. с. пв. aesculi PD4818-pMP4655 отслеживали после того, как инфицированные растения инкубировали при 39 ° C в течение 48 часов.Из зараженных участков термически обработанных растений не было повторно выделено никаких жизнеспособных бактерий, в то время как все необработанные поражения легко давали P. s. пв. aesculi PD4818-pMP4655 (таблица 2). У термически обработанных растений не было видимых повреждений, за исключением случайных повреждений краев листьев. Эти наблюдения показывают, что двухдневной инкубации при 39 ° C достаточно для инактивации бактерий, связанных с активными поражениями, при минимальном воздействии на растение-хозяин, таким образом подтверждая концепцию тепловой обработки как высокопотенциального метода борьбы с кровотечением из конского каштана. прогрессирование болезни.
Обсуждение
Недавнее появление П. с. пв. aesculi как патоген, поражающий стволы и ветви Aesculus spp. серьезно повлияло на жизнеспособность популяции этих деревьев, которые высоко ценятся за свою декоративную ценность. Хотя геномные данные пролили некоторый свет на происхождение патогенеза, гистопатология этого взаимодействия оставалась неизвестной. В этой работе гистологические события после вхождения хозяином P.с. пв. aesculi и его поведение in planta . Анализировали гистологические реакции на повреждение коры, распространение и кластеризацию бактерий.
Гистохимически наблюдаемая выстилка клеток с одревесневшими и суберизованными клеточными стенками в коре A. hippocastanum была описана для различных других видов деревьев [13] — [16]. Кроме того, в соответствии с этими более ранними сообщениями, временной интервал, в течение которого он обнаруживается в конском каштане, составляет порядка нескольких дней.Однако прямое сравнение скорости его строительства затруднительно из-за сильной корреляции с температурой окружающей среды [29].
Как при наличии, так и при отсутствии шт. pv aesculi , поврежденная ткань коры показала одревеснение и суберизацию клеток паренхимы, граничащих с раной, в одинаковой степени, что позволяет предположить, что этот процесс является частью внутренней защитной реакции A. hippocastanum . Однако могут присутствовать тонкие различия, как сообщается для некоторых растений в присутствии грибковых патогенов [17], [30].Тем не менее, наблюдаемая реакция, по-видимому, носит в целом защитный характер [31], так что возможная специфическая связь с присутствием патогена неясна.
При мониторинге проникновения бактерий выяснилось, что одревесневший и суберизованный барьер был недостаточным или построен слишком поздно, чтобы защитить нижележащую здоровую ткань (рис. 2А). Примечательно, что барьер иногда казался немного слабее рядом с вторгающимися бактериями, намекая на патоген-опосредованную дегенерацию (рис. 2А). Этому могут способствовать различные пути разложения родственных лигнину соединений, обнаруженных в P.с. pv aesculi геном [8]. Хотя не является определяющим при ограничении P. s. пв. aesculi , наличие наблюдаемого барьера может играть полезную защитную роль. Например, он может препятствовать потоку воды и минералов к бактериям, предотвращать диффузию бактериальных токсинов и эффекторов в здоровые ткани растений, снижать перевариваемость тканей и придавать жесткость, предотвращая дальнейшее разрушение тканей.
Бактериальная инфекция распространялась не системно через сосудистые элементы, а в основном в паренхиме коры и, предположительно, через межклеточное пространство (рис.2Л, М). Если предположить, что этот тип ткани менее способствует распространению бактерий, это наблюдение может объяснить относительно низкую скорость расширения очага поражения, которая, по измерениям, составляет от 100 мкм / день [1] до 1000 мкм / день (наш неопубликованные данные). Помимо распространения по паренхиме, бактерии часто обнаруживались на волокнах склеренхимы (рис. 2C, N). В то время как локализация и продольная ориентация этих элементов совпадает с местом распространения поражения (Рис. 3B), никакая функция патогенности или бактериального распространения не может быть однозначно отнесена к этой очевидной ассоциации.Однако развитие перидермы вокруг инфицированных волокон флоэмы (Fig. 2P) ограничивает латеральное, а не продольное распространение, потенциально объясняя удлиненный характер повреждений. Поскольку проводящая ткань для разрастания поражения выглядит как паренхима коры и / или склеренхима, будет интересно раскрыть средства, с помощью которых бактериальные клетки мигрируют через эти ткани. Особый интерес представляет потенциальная функция межклеточного пространства при бактериальном распространении. У взрослых деревьев, помимо удлиненных поражений, наблюдаются также распространяющиеся вбок поражения [11], что позволяет предположить, что при отдельных инфекциях могут преобладать различные способы колонизации.
Бактериальные клетки, обнаруженные на переднем крае распространения инфекции, были небольшими и плотно сгруппированными (рис. 3D). Точно так же симптомы заболевания на клеточном уровне включали случайную колонизацию отдельных клеток паренхимы флоэмы / коры большим бактериальным кластером (рис. 2B, J). Эти локальные скопления бактерий могут быть важны в инфекционном процессе, поскольку проявление патогенных признаков часто требует определенной, скоординированной, скоординированной плотности клеток [32]. То, что такая система контроля кворума может действовать в пределах наблюдаемых бактериальных кластеров в тканях конского каштана, подтверждается размером кворума, описанным для P.syringae (до ∼20 особей [33]) и способность индийских P. s. пв. aesculi для производства N -ацилгомосериновых лактонов [34].
На более поздних стадиях заболевания (т. Е. Через несколько недель после заражения) бактерии все еще обнаруживались в некротизированных тканях (рис. 2Q – T; рис. 3E, F). Сохранение бактерий ex planta в поврежденных тканях может способствовать распространению и повторному заражению позже. Люди были неподвижны и располагались на некотором расстоянии друг от друга, что свидетельствует о слизистом геле, в котором содержались бактерии (рис.3G, H). Аналогичные наблюдения были выполнены на P. savastanoi pv. savastanoi во время эндофитного образа жизни в стеблях оливок [35]. Такой гель может помочь бактериям создать стрессоустойчивое микроокружение в организме хозяина, например, повысить устойчивость к дегидратации и токсичным соединениям [26], [36], [37]. Точно так же он также может способствовать выживанию бактерий на внешних тканях [38], [39]. Высокая эпифитическая пригодность может увеличить окно возможностей на P. s. пв. aesculi для доступа к тканям хозяина.
Помимо устойчивости к стрессу окружающей среды, наблюдаемая матрица может играть прямую роль в патогенности. Одной из таких функций может быть подавление передачи сигналов защиты хозяина посредством хелатирования Ca 2+ [40]. Другой потенциальный механизм, посредством которого мукоидный гель может способствовать вирулентности, был описан для бактериального ожога груши, вызываемого Erwinia amylovora , где внеклеточный матрикс, как предполагается, управляет расширением поражения [41], [42].При повышении водного потенциала матрица может оказывать давление на ткани-хозяева, что может даже способствовать нарушению защитных барьеров, построенных растением-хозяином [41]. Если аналогичный механизм сработает в течение пс. пв. aesculi , такие толкающие силы также могут частично объяснять сезонное образование экссудата, обычно связанное с активными поражениями (рис. 1А).
Сканирующая электронная микроскопия показала, что промежуточное пространство внутри аксенически выращенного бактериального кластера состоит из фибриллярного материала (рис.4А). Внеклеточные полимерные вещества, продуцируемые штаммами P. syringae , включают леван и альгинат [22], [24], [26], [43]. Наши результаты демонстрируют присутствие маннуроновой и гулуроновой кислоты после гидролиза внеклеточных полисахаридов, продуцируемых культурами клеток в условиях солевого стресса. Таким образом, альгинат, вероятно, является компонентом внеклеточного матрикса, как обнаружено у многих фитопатогенных псевдомонад [23], [25]. В то время как изоляты П. с. пв. Сообщалось, что aesculi положительно влияет на продукцию левана [9], результаты HPAEC для гидролизованных экзополисахаридов в нашем исследовании не показали присутствия фруктозы, что исключает продукцию левана в исследуемых условиях.О присутствии глюкозы, рамнозы и глюкуроновой кислоты вместе с альгинатами во внеклеточном матриксе сообщалось для P . syringae pv. syringae [22] и согласуется с нашими результатами. Способность П. с. пв. aesculi для производства альгината поддерживается полным набором биосинтетических и регуляторных генов (Таблица S1). Кроме того, не охарактеризованные компоненты могут вносить вклад в матрицу, вмещающую бактериальные клетки [43].Кроме того, дополнительного внимания требуют факторы, координирующие его производство.
Появление бактерий, встроенных в матрикс, в тканях хозяина в сочетании с расширением очага поражения, которое происходит в основном под перидермой (рис. 3B), означает, что после эндофитического установления патоген становится плохо доступным извне. Это может ограничить эффективность борьбы с болезнями агентами, требующими физического контакта. Действительно, установившиеся язвы на фруктовых деревьях, вызванные P. syringae , как известно, трудно поддаются контролю [28].Таким образом, за управление шт. пв. aesculi может иметь значение для нацеливания на другие части (в значительной степени неизвестного) цикла болезни или установления мер, которые могут проникнуть, чтобы достичь внутренних бактериальных популяций. С этой целью был разработан и испытан метод контроля на основе тепла на саженцах A. hippocastanum .
Новаторские эксперименты по проверке эффективности термической обработки целых растений показали, что P. s. пв. aesculi , связанное с активными поражениями, становится неактивным после двухдневного воздействия температуры 39 ° C, которое переносится A.hippocastanum . Следовательно, термическая обработка может быть осуществимым неинвазивным методом борьбы с заболеванием в более крупном масштабе. Потенциальная проблема с применением термообработки в полевых условиях может заключаться в различиях в температурной чувствительности, которые могут возникать между различными изолятами, как сообщается для Erwinia amylovora [44]. Однако чрезвычайно высокая генетическая однородность среди UK P. s. пв. Изоляты aesculi [8] подразумевают, что различия в термостойкости среди бактериальных штаммов минимальны, что предполагает термообработку A.hippocastanum может быть широко применимым методом.
На сегодняшний день борьба с фитопатогенами на основе тепла зарекомендовала себя как полезный метод борьбы с различными послеуборочными заболеваниями [45], [46]. Результаты, представленные в этом исследовании, демонстрируют, что тепловая обработка может также использоваться на растущих вегетативных органах растений в качестве стратегии контроля для инактивации P. s. пв. летучие мыши . Такая обработка может применяться к семенам, саженцам и пораженным надземным органам деревьев, что будет проверено в будущих исследованиях.Однако для зрелых деревьев следует учитывать такие осложняющие факторы, как вторичное заражение условно-патогенными микроорганизмами или повторное заражение. Тем не менее, тепловая обработка может сместить баланс во взаимодействии патогенов растений в пользу хозяина, обеспечивая достаточное восстановление и оживление в случае смертельной инфекции. Кроме того, высокий потенциал отражения этой конкретной болезни может означать, что эту стратегию можно расширить для борьбы с аналогичными заболеваниями у других видов деревьев, вызываемыми родственными бактериальными патогенами.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы, условия культивирования и плазмиды
Pseudomonas syringae pv. штаммов aesculi (перечисленных в таблице 1) выращивали в бульоне Lysogeny (LB; [47]) при 28 ° C и 180 об / мин. штаммов E. coli (таблица 1) обычно культивировали в LB при 37 ° C и 225 об / мин. Плазмида pMP4655 (полученная из отдела молекулярной микробиологии Лейденского университета; таблица 1) была введена в E.coli DH5α и GM119 путем электропорации.Антибиотики добавляли в следующих концентрациях, если не указано иное: тетрациклин, 40 мкг / мл; карбенициллин, 100 мкг / мл и канамицин, 50 мкг / мл. Штаммы хранили при -80 ° C для длительного хранения.
Преобразование
П. с. пв. aesculi , полученное тройным родителемДва штамма донора E. coli , несущие pMP4655, штамм-помощник cel40, содержащий pRK2013, и реципиентный штамм P. s. пв. штаммов aesculi выращивали до поздней логарифмической фазы.Антибиотики, присутствующие в исходной культуральной среде, сначала удаляли путем сбора клеток при 1000 × г в течение 5 минут и ресуспендирования их в исходном культуральном объеме LB. Все культуры снова осаждали и ресуспендировали в 3% от исходного объема LB. Аликвоты по 30 мкл смешивали в соотношении 1: 1: 2,5 и 1: 1: 5 (помощник: донор: реципиент) и переносили в стерильные нитроцеллюлозные фильтры BA85 диаметром 20 мм с размером пор 0,45 мкм (Schleicher & Schuell), которые инкубировали в течение ночи на чашках LB.Клетки собирали с фильтров в 1 мл PBS и высевали на планшеты LB, содержащие карбенициллин и 15 мкг / мл тетрациклина. Хорошо выросшие колонии серийно разводили в PBS и повторно наносили на планшеты, содержащие карбенициллин и 30 мкг / мл тетрациклина, с получением чистых P. s. пв. трансформантов aesculi . Оба штамма донора E. coli оказались одинаково эффективными для конъюгального переноса pMP4655.
Выращивание и инокуляция растений
Для анализа ранней защитной реакции и бактериальной инвазии при инокуляции были проведены эксперименты с однолетним и двухлетним конским каштаном ( A . hippocastanum ) саженцы. Растения содержали при комнатной температуре при естественном освещении в контейнерах с 5 л горшечной почвы и поливали еженедельно. Опыты повторяли трижды. Всего восемь растений были инокулированы в различных участках стебля для своевременного отбора проб, две инокуляции — на противоположных сторонах стебля. В каждый момент взятия пробы (см. « Отбор проб, фиксация и секционирование ») удаляли один набор противоположных мест посева. Растения либо имитировали в качестве контроля (всего 3 растения), либо инокулировали P.с. пв. aesculi (всего 5 растений). При искусственном заражении растений на стерилизованную поверхность стебля наносили поверхностную рану, делая небольшой (2–3 мм) диагональный надрез под углом вниз стерильным бритвенным лезвием. Следили за тем, чтобы не порезать глубже камбиальной зоны. В эти раны засевали пипеткой 5 мкл стерильного PBS или 5 мкл PBS, содержащего 10 8 КОЕ / мл P. s. пв. aesculi PD4818 в трещину раны.
Для анализа распространения бактерий в долгосрочной перспективе 20 растений были инокулированы на 6 участках на одно растение (включая 5 фиктивных инокулированных растений). В каждый момент взятия пробы собирали 4 растения (одно из них имитировали инокуляцию), и из каждого растения случайным образом отбирали один образец для анализа.
Эксперименты по заражению бактериями, экспрессирующими GFP (изолят PD4818, несущий pMP4655), были выполнены в трех отдельных случаях в климатических клетках с использованием 6 двухлетних проростков конского каштана, выдерживаемых при 21 ° C, относительной влажности 70–90% и 16-часовом освещении, 8 часов. темный цикл.Образцы растений отбирали через 4 и 6 недель для исследования поведения бактерий in planta и наблюдали в течение 8 недель.
Отбор, фиксация и разрезание проб
Для анализа ранних стадий процесса заражения образцы стебля были взяты из инокулированных проростков вокруг исходного места инокуляции через 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 и 14 дней после инокуляции. Для исследования более поздних стадий образцы отбирали через 2, 3, 4, 10 и 18 недель после инокуляции.Отобранные кусочки стебля фиксировали в 4% параформальдегиде (мас. / Об.), 0,05% об. / Об. Глутарового альдегида и 0,01% об. / Об. Triton X-100 в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2) путем вакуумной инфильтрации (10 кПа). Эксперименты по заражению GFP-экспрессирующими бактериями отбирали образцы через 4 и 6 недель после инокуляции, и проверяли два места инокуляции для каждой временной точки. При приготовлении образцов с бактериями, экспрессирующими GFP, этап фиксации не проводился. Поперечный и продольный срезы толщиной ∼20 мкм изготавливали на санном микротоме Reichert.Фиксированные образцы хранили в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 0,02% мас. / Об. NaN 3 при 4 ° C.
Окрашивание и иммуномарка
Для окрашивания лигнина срезы инкубировали в 10% мас. / Об. Флороглюцине в этаноле в течение 20 мин, а затем в 20% об. / Об. HCl в течение 3 мин. Затем срезы дважды промывали в течение 30 секунд в dH 2 O и помещали в глицерин. Чтобы окрашивать жиры и воск, срезы инкубировали в 1% -ном растворе Судана IV в течение 10 минут, промывали в 50% -ном об. Этаноле в течение 1 минуты и помещали на предметное стекло в глицерине.Дикий тип P. s. пв. aesculi визуализировали с использованием конъюгированных с FITC антител против PRI1 (PRI, Вагенинген, Нидерланды). Срезы промывали в PBS в течение 10 минут, инкубировали в 0,1 М гидроксиламмонийхлориде в течение 30 минут и снова промывали в PBS в течение 5 минут. Срезы блокировали 0,5% масс. / Об. Фракцией V бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут и дважды промывали PBS в течение 15 минут. Образцы инкубировали в течение ночи при 4 ° C в анти-PRI1-FITC, разведенном 1–600 или 1–1200 в PBS, дважды промывали в течение 15 минут и дважды в течение 30 минут в PBS.Наконец, срезы помещали на предметные стекла в глицерине Citifluor AF2 для микроскопического наблюдения. Для оценки жизнеспособности бактерий, выращенных в жидкости, окрашивали йодидом пропидия (Sigma) до конечной концентрации 5 мкМ в течение 5 минут в темноте.
Получение и обработка изображений
Слайды с бактериями, меченными анти-PRI1-FITC и GFP, анализировали с помощью микроскопа Nikon Optiphot в условиях яркого поля и флуоресценции. Для флуоресценции использовались ртутная лампа высокого давления HB-10101AF мощностью 100 Вт (Nikon) и фильтры FITC.Изображения были получены камерой Kappa DX-20. Для меньшего увеличения использовался стереомикроскоп Zeiss Discovery V12, оборудованный камерой JENOPTIK ProgRes C10 +. Бактериальные кластеры, выращенные по аксениче, наблюдались с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200 M, подключенного к конфокальной сканирующей системе Zeiss LSM510 META, с использованием масляного иммерсионного объектива 63 × PlanApochromat 1.4 N.A. Все изображения обрабатывались с помощью ImageJ 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) и Photoshop 8 CS (Adobe systems Inc.).
Производство внеклеточного матрикса in vitro и сканирующая электронная микроскопия
Для наблюдения за производством внеклеточного материала, P.с. пв. aesculi PD4818 и его производное, несущее pMP4655, культивировали при 20 ° C либо в LB, либо в минимальной среде, содержащей 20 мМ NaCl, 20 мМ фосфатный буфер, 10 мМ (NH 4 ) 2 SO 4 , 5 мМ MgSO 4 , 10 мМ фруктозы и 10 мМ маннита (pH 6,1) [50], [51]. Через 2–3 дня культуры наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии, как описано выше, или готовили для сканирующей электронной микроскопии, фиксируя образцы объемом 1 мл 3% об. / Об. Глутаровым альдегидом, растворенным в соответствующей среде.Капли образца наносили на круглые покровные стекла, покрытые поли-L-лизин гидробромидом (Sigma) (Menzel). После промывки водой образцы были обезвожены в серии растворов ацетона, а затем высушены до критической точки диоксидом углерода с использованием BalTec CPD 030. Образцы были покрыты напылением платиной 5 нм в специальной камере для подготовки (CT 1500 HF, Oxford Instruments) и анализировали с помощью автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа JEOL 6300F. Изображения были записаны в цифровом виде с использованием интерфейса Orion 6 PCI (Eli SPRL) и обработаны с помощью Adobe Photoshop 8 CS.
Характеристика внеклеточных полисахаридов
Культуры 125 мл P. s. пв. aesculi PD4818 выращивали либо in duplo в минимальной среде в течение 5 дней, либо в минимальной среде в течение 3 дней, а затем в условиях солевого стресса (0,4 M NaCl в минимальной среде) в течение 2 дней. Культуры центрифугировали в течение 15 мин (10000 × г, , RT) и к супернатанту добавляли три объема ледяного этанола для осаждения внеклеточного материала o / n при 4 ° C.Осадок собирали после центрифугирования (30 мин, 10,000 × g, , 4 ° C) и впоследствии подвергали диализу (Медикелл Вискинг, MWCO 12,000–14,000 Да) против dH 2 О. Четыре объема ледяного ацетона были добавляли к ретентату и после осаждения при 4 ° C внеклеточный материал собирали центрифугированием в течение 30 мин при 10,000 × g (10 ° C). Твердый материал промывали ацетоном и сушили при 35 ° C. Коммерческие альгинаты, альгинат натрия из Laminaria hyperborea (BDH Chemicals) и Macrocystis pyrifera (Sigma-Aldrich), а также высушенный внеклеточный материал гидролизовали в 0.375 мл 72% (мас. / Об.) H 2 SO 4 в течение 30 минут при 30 ° C, продолжение в 1 M H 2 SO 4 в течение 3 часов при 100 ° C. Количество уроновых кислот определяли с использованием анализа м -гидроксидифенила, как описано Блюменкранцем и Асбое-Хансеном [52], и галактуроновую кислоту использовали в качестве стандарта.
Состав сахаров был определен более подробно с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии (HPAEC) с использованием системы ВЭЖХ для ионной хроматографии ICS-3000, снабженной колонкой CarboPac PA-1 (2 × 250 мм) в сочетании с защитной колонкой CarboPac PA ( 2 × 25 мм) и импульсный электрохимический детектор в импульсном амперометрическом режиме детектирования (Dionex).Использовали скорость потока 0,3 мл мин. -1 , и колонку уравновешивали 16 мМ NaOH. Использовали следующий градиент: 0–26 мин, 16 мМ NaOH; 26–33 мин, 16–100 мМ NaOH; 33–78 мин 0–1 М ацетат натрия в 100 мМ NaOH; 78–83 мин. 1 М ацетат натрия в 100 мМ NaOH. Перед анализом образцы разбавляли водой и к образцам добавляли 2,5 мкл / мл 0,1% бромфенолового синего в этаноле. Для регулирования pH добавляли твердый карбонат натрия до получения прозрачного пурпурного цвета. Впоследствии раствор фильтровали через фильтр 0.Фильтр из ПТФЭ 45 мкм. Рамнозу, фукозу, маннит, арабинозу, глюкозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, глюкуроновую кислоту и галактуроновую кислоту (Sigma Aldrich) использовали в качестве стандартов для идентификации.
Термическая обработка
Для проверки эффективности термической обработки активных поражений восемь 4-летних саженцев A. hippocastanum инокулировали P. s. пв. aesculi, PD4818-pMP4655 и два растения инокулировали PBS. Саженцы содержали в климатических камерах, как описано выше.Через два месяца после инокуляции половину популяции накрыли пластиком и инкубировали в климатической камере, нагретой до 39 ° C, в течение 48 часов. После этого растения снова инкубировали в стандартных условиях. Через день после обработки со всех стеблей саженца удалили расширенные очаги, всегда исключая место первоначальной инокуляции (за исключением имитационных инокуляций). Образцы гомогенизировали и помещали в количество PBS, пропорциональное весу взятой в образец ткани. Затем на планшеты с карбенициллином, содержащие LB, наносили эквивалент 0,5 мг ткани и серию из семи последующих 10-кратных разведений.Планшеты инкубировали при 20 ° C в течение 4 дней, а затем оценивали рост бактерий. Идентичность выделенных бактерий подтверждена флуоресцентной микроскопией. После термообработки в течение 2 месяцев наблюдали за ростом и внешним видом растений.
Благодарности
E. L. Lagendijk и C. A. M. J. J. Van den Hondel с кафедры молекулярной микробиологии Лейденского университета признательны за их советы и любезный дар плазмид. Мы благодарим A.C. van Aelst за помощь с электронной микроскопией, H.Кифту за подготовку образцов и А.Г. Спекснидеру за поставку антител против PRI1. Мы благодарим K. Bouwmeester, F. Govers и R. Weide за щедрое предоставление пространства для роста.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: JdK LvdB TK AvL. Провел эксперименты: JdK LvdB AvL. Проанализированы данные: JdK LvdB AvL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JdK LvdB TK AvL. Написал статью: JdK AvL.
Ссылки
- 1. Bultreys A, Gheysen I, Planchon V (2008) Характеристика штаммов Pseudomonas syringae , выделенных из больных конских каштанов в Бельгии.В: Фатми М., Коллмер А., Якобеллис Н.С., редакторы. Дордрехт, Нидерланды: Springer, 283–293.
- 2. Schmidt O, Dujesiefken D, Stobbe H, Moreth U, Kehr R и др. (2008) Pseudomonas syringae pv. aesculi , связанный с кровотечением из конского каштана в Германии. Лесная патология 38: 124–128.
- 3. Webber JF, Parkinson NM, Rose J, Stanford H, Cook RTA и др. (2008) Выделение и идентификация Pseudomonas syringae pv. aesculi вызывает кровотечение из язвы конского каштана в Великобритании. Патология растений 57: 368.
- 4. Dijkshoorn-Dekker MWC (2005) Eindrapport onderzoeksprogramma «Red de kastanje voor Nederland» . Прикладные исследования растений, Boskoop, Нидерланды.
- 5. Green S, Laue B, Fossdal CG, A’Hara SW, Cottrell JE (2009) Заражение конского каштана ( Aesculus hippocastanum ) Pseudomonas syringae pv. aesculi и его обнаружение с помощью количественной ПЦР в реальном времени.Патология растений 58: 731–744.
- 6. Brasier CM, Strouts RG (1976) Новые записи о Phytophthora на деревьях в Великобритании: I. Phytophthora гниль корней и кровоточащий язвы конского каштана ( Aesculus hippocastanum L.). Европейский журнал лесной патологии 6: 129–136.
- 7. Дургапал Дж. К., Сингх Б. (1980) Таксономия псевдомонад, патогенных для конского каштана, дикого инжира и дикой вишни в Индии. Индийская фитопатология 33: 533–535.
- 8. Green S, Studholme DJ, Laue BE, Dorati F, Lovell H и др. (2010) Сравнительный анализ генома дает представление об эволюции и адаптации Pseudomonas syringae pv. aesculi на конском каштане европейском. PLoS ONE 5, e10224.
- 9. Dijkshoorn-Dekker MWC, van Os GJ (2009) Eindrapport onderzoeksprogramma «Behoud de kastanje, Deel 3 ″ . Прикладные исследования растений, Лиссе, Нидерланды.
- 10.Dijkshoorn-Dekker MWC (2008) Eindrapport onderzoeksprogramma «Behoud de kastanje, Deel 2 ″ . Прикладные исследования растений, Лиссе, Нидерланды.
- 11. Steele H, Laue BE, MacAskill GA, Hendry SJ, Green S (2010) Анализ естественной инфекции европейского конского каштана ( Aesculus hippocastanum ) Pseudomonas syringae pv. летучие мыши . Патология растений 59: 1005–1013.
- 12. Шиго А.Л. (1984) Компартментализация: концептуальная основа для понимания того, как деревья растут и защищаются.Ежегодный обзор фитопатологии 22: 189–214.
- 13. Биггс А.Р. (1985) Зуберизированные пограничные зоны и хронология раневой реакции коры дерева. Фитопатология 75: 1191–1195.
- 14. Риттингер П.А., Биггс А.Р., Пирсон Д.Р. (1987) Гистохимия отложения лигнина и суберина в пограничных слоях, образованных после ранения в различных видах растений и органах. Канадский журнал ботаники 65: 1886–1892.
- 15. Woodward S, Pocock S (1996) Формирование лигно-суберизованной барьерной зоны и раневой перидермы у четырех видов европейских широколиственных деревьев.Европейский журнал лесопатологии 26: 97–105.
- 16. Simard M, Rioux D, Laflamme G (2001) Формирование лигно-суберизованных тканей у сосны обыкновенной, устойчивой к европейской расе Gremmeniella abietina . Фитопатология 91: 1128–1240.
- 17. Гаррод Б., Льюис Б.Г., Бриттен М.Дж., Дэвис В.П. (1982) Исследования вклада лигнина и суберина в импеданс поврежденной ткани корня моркови для грибковой инвазии. Новый фитолог 90: 99–108.
- 18.Bloemberg GV, Wijfjes AHM, Lamers GEM, Stuurman N, Lugtenberg BJJ (2000) Одновременная визуализация популяций Pseudomonas fluorescens WCS365, экспрессирующих три разных аутофлуоресцентных белка в ризосфере: новые перспективы изучения микробных сообществ. Молекулярные взаимодействия растений и микробов 13: 1170–1176.
- 19. Хиб С., Ито Й, Нисиджио Т., Шнидер У, Кил С. и др. (2000) Небольшие стабильные челночные векторы на основе минимального репликона pVS1 для использования в грамотрицательных бактериях, ассоциированных с растениями, Molecular Plant-Microbe Interactions 13: 232–237.
- 20. Bassett CL, Janisiewicz WJ (2003) Электропорация и стабильное поддержание плазмидных ДНК в штамме биоконтроля Pseudomonas syringae . Письма о биотехнологии 25: 199–203.
- 21. Stuurman N, Pacios Bras C, Schlaman HRM, Wijfjes AHM, Bloemberg GV и др. (2000) Использование цветных вариантов зеленого флуоресцентного белка, экспрессированных на стабильных векторах с широким кругом хозяев, для визуализации ризобий, взаимодействующих с растениями. Молекулярные взаимодействия растений и микробов 13: 1163–1169.
- 22. Чанг В., ван де Мортель М., Нильсен Л., Нино де Гусман Г., Ли Х и др. (2007) Производство альгината Pseudomonas putida создает гидратированную микросреду и способствует архитектуре биопленки и устойчивости к стрессу в условиях ограничения воды. Журнал бактериологии 189: 8290–8299.
- 23. Фетт В.Ф., Осман С.Ф., Фишман М.Л., Сиблс Т.С. (1986) Производство альгината патогенными псевдомонадами растений. Прикладная и экологическая микробиология 52: 466–473.
- 24. Осман С.Ф., Фетт В.Ф., Фишман М.Л. (1986) Экзополисахариды фитопатогена Pseudomonas syringae pv. glycinea . Журнал бактериологии 166: 66–71.
- 25. Fett WF, Dunn MF (1989) Экзополисахариды, продуцируемые фитопатогенными патоварами Pseudomonas syringae в инфицированных листьях восприимчивых хозяев. Физиология растений 89: 5–9.
- 26. Денни Т.П. (1995) Участие бактериальных полисахаридов в патогенезе растений.Ежегодный обзор фитопатологии 33: 173–197.
- 27. Chitnis CE, Ohman DE (1993) Генетический анализ кластера альгинатных биосинтетических генов Pseudomonas aeruginosa показывает доказательства оперонической структуры. Молекулярная микробиология 8: 583–590.
- 28. Kennelly MM, Cazorla FM, de Vicente A, Ramos C, Sundin GW (2007) Pseudomonas syringae болезней фруктовых деревьев; Прогресс к пониманию и контролю. Болезнь растений 91: 4–16.
- 29. Биггс А.Р. (1986) Прогнозирование отложения лигнина и суберина в ткани пограничной зоны коры раненого дерева с использованием накопленных градусо-дней, Журнал Американского общества садоводческих наук 111: 757–760.
- 30. Ride JP (1975) Одревеснение поврежденных листьев пшеницы в ответ на действие грибов и его возможная роль в устойчивости. Физиологическая патология растений 5: 125–134.
- 31. Mullick DB (1977) Неспецифический характер защиты коры и древесины во время ранения, нападения насекомых и патогенов.Последние достижения в фитохимии 11: 395–441.
- 32. Quiñones B, Dulla G, Lindow S (2005) Зондирование кворума регулирует продукцию, подвижность и вирулентность экзополисахаридов в Pseudomonas syringae . Молекулярные взаимодействия растений и микробов 18: 682–693.
- 33. Dulla G, Lindow SE (2008) Размер кворума Pseudomonas syringae невелик и определяется наличием воды на поверхности листа. Труды Национальной академии наук США 105: 3082–3087.
- 34. Эласри М., Делорм С., Лемансо П., Стюарт Г., Лауэ Б. и др. (2001) Производство ацилгомосеринового лактона более распространено среди ассоциированных с растениями Pseudomonas spp. чем среди почвенных Pseudomonas spp. Прикладная и экологическая микробиология 67: 1198–1209.
- 35. Родригес-Морено Л., Хименес А.Дж., Рамос С. (2009) Эндопатогенный образ жизни Pseudomonas savastanoi pv savastanoi в оливковых узлах. Микробная биотехнология 2: 476–488.
- 36. Рудольф КВЕ, Гросс М., Эбрагим-Несбат Ф., Нёлленбург М., Зомородиан А. и др. (1994) Роль внеклеточного полисахарида как факторов вирулентности для фитопатогенных псевдомонад и ксантомонад. В: Kado CI, Crosa JH, редакторы. Дордрехт, Нидерланды: Kluwer Academic Publishers, 357–378.
- 37. Keith LMW, Bender CL (1999) AlgT (σ 22 ) контролирует выработку альгината и устойчивость к стрессу окружающей среды у Pseudomonas syringae .Журнал бактериологии 181: 7176–7184.
- 38. Yu J, Peñaloza-Vázquez A, Chakrabarty AM, Bender CL (1999) Участие альгината экзополисахарида в вирулентности и эпифитной пригодности Pseudomonas syringae pv. сиринги . Молекулярная микробиология 33: 712–720.
- 39. Peñaloza-Vázquez A, Fakhr MK, Bailey AM, Bender CL (2004) Функции AlgR в экспрессии algC и вирулентности в Pseudomonas syringae pv. сиринги . Микробиология 150: 2727–2737.
- 40. Аслам С.Н., Ньюман М., Эрбс Г., Моррисси К.Л., Шиншилла Д. и др. (2008) Бактериальные полисахариды подавляют индуцированный врожденный иммунитет за счет хелатирования кальция. Текущая биология 18: 1078–1083.
- 41. Schouten HJ (1989) Возможная роль в патогенезе набухания внеклеточной слизи Erwinia amylovora при увеличении водного потенциала. Нидерландский журнал патологии растений 95: 169–174.
- 42. Замски Э., Штиенберг Д., Блачинский Д. (2006) Роль экссудации слизи в миграции клеток Erwinia amylovora на деревьях груш, пораженных бактериальным ожогом, Израильский журнал наук о растениях 54: 301–307.
- 43. Лауэ Х., Шенк А., Ли Х., Ламбертсен Л., Ной Т. Р. и др. (2006) Вклад продукции альгината и левана в образование биопленок Pseudomonas syringae . Микробиология 152: 2909–2918.
- 44. Кек М., Шартье Р., Зиславский В., Лекомте П., Паулин П. (1995) Термическая обработка материала для размножения растений для борьбы с бактериальным ожогом.Патология растений 44: 124–129.
- 45. Маккей Дж. М., Шиптон П. Дж. (1983) Термическая обработка семенных клубней для борьбы с черной ножкой картофеля ( Erwinia carotovora subsp. atroseptica ) и другими болезнями. Патология растений 32: 385–393.
- 46. Harnik TY, Mejia-Chang M, Lewis J, Garbelotto M (2004) Эффективность обработки на основе тепла в устранении восстановления патогена внезапной смерти дуба ( Phytophthora ramorum ) из инфицированных листьев лавра калифорнийского залива.HortScience 39: 1677–1680.
- 47. Бертани Г. (1951) Исследования лизогенеза. I. Способ высвобождения фага лизогенной Escherichia coli , Journal of Bacteriology 62: 293–300.
- 48. Ханахан Д. (1983) Исследования трансформации Escherichia coli плазмидами. Журнал молекулярной биологии 166: 557–580.
- 49. Фигурски Д.Х., Хелински Д.Р. (1979) Репликация производного плазмиды RK2, содержащего ориджин, в зависимости от функции плазмиды, представленной в транс.Труды Национальной академии наук США 76: 1648–1652.
- 50. Huynh TV, Dahlbeck D, Staskawicz BJ (1989) Бактериальный ожог сои: регуляция гена патогена, определяющего специфичность сорта хозяина. Science 245: 1374–1377.
- 51. Schulte R, Bonas U (1992) Локус патогенности Xanthomonas индуцируется сахарозой и серосодержащими аминокислотами. Растительная клетка 4: 79–86.
- 52. Блюменкранц Н., Асбоэ-Хансен Г. (1973) Новый метод количественного определения уроновых кислот.Аналитическая биохимия 54: 484–489.
Термическая обработка против кровотечения из конского каштана доступна
Кровоточащий язвы из конского каштана является наиболее опасным заболеванием для конских каштанов (разновидность Aesculus). Очень заразный, он вызывается бактериями, которые гнездятся в клетках коры дерева, которые отвечают за транспортировку пищи. Это приводит к отмиранию клеток и вызывает внешнее кровотечение древесного сока. По мере отмирания коры сократительный поток от ветвей к корням уменьшается, что может привести к гибели дерева.
Ведение болезней
Различные методы и средства борьбы с этим заболеванием были опробованы после крупного прорыва кровотечения из язвы конского каштана в Нидерландах в 2005 году. Однако до недавнего времени эти усилия не давали удовлетворительных результатов. В 2011 году ученые Wageningen UR в ходе лабораторных и тепличных испытаний обнаружили, что бактерия, вызывающая кровотечение из язв конского каштана — Pseudomonas syringae pv aesculi — чувствительна к более высоким температурам.Помещение молодых каштанов в отапливаемую теплицу при температуре около 39oC на несколько дней привело к гибели бактерий, но не дерева. Результаты были настолько обнадеживающими, что было решено провести испытания на открытом воздухе с более крупными деревьями.
Испытания на практике
С 2013 года в муниципалитетах Нидерландов проводились различные практические испытания. Они заключались в наложении «тепловой мантии» вокруг ствола взрослых конских каштанов, которая поддерживает высокую температуру в течение нескольких дней.Практические испытания показали, что болезнетворные бактерии исчезли в обработанной части ствола, что помогло дереву преодолеть повреждение. Дальнейшее применение покажет, достаточно ли однократной обработки или необходимо повторять лечение через какое-то время.
Лицензия
В этом году Wageningen UR заключила лицензионный контракт для Нидерландов с голландской компанией по уходу за деревьями Prop Boomtechniek. Кровотечение из конского каштана также является проблемой в других странах.Существуют также возможности лицензирования, доступные для иностранных компаний, заинтересованных в применении метода термической обработки для больных конских каштанов в их собственной стране.
Мониторинг обработанных деревьев
В ближайшие годы будет вестись мониторинг развития всех обработанных деревьев в Нидерландах. Wageningen UR будет продолжать участвовать в управлении программой мониторинга и регулярно анализировать результаты. Цель состоит в том, чтобы максимально освободить стволы деревьев от болезнетворных бактерий, чтобы у дерева была возможность преодолеть повреждение и выздороветь, стимулированные методом термической обработки.
В настоящее время неизвестно, как долго продлится эффект от обработки, поскольку бактерия все еще присутствует в окружающей среде, например, в или на необработанных частях дерева. Программа мониторинга была создана, чтобы ответить на этот вопрос.
Что не так с моим конским каштаном
Большое красивое дерево с эффектными белыми цветами, лошадь. каштан часто используют как образец ландшафта или для выравнивания улиц в жилые кварталы. Безупречный навес идеально подходит для создания тени а весеннее цветение — долгожданный знак нового сезона. Aesculus hippocastanum является родным для части Европы, но сейчас растет в большинстве районов Северной Америки. Несмотря на привлекательность, однако проблемы с конским каштаном могут возникать и возникают.
Что не так с моим конским каштаном?
Как и все деревья, всегда есть вероятность заражения вредителями. инвазия и инфекционное заболевание. Эти деревья популярны, но в последнее время испытали серьезные проблемы со здоровьем из-за минера листьев конского каштана и язвы с бактериальным кровотечением.Как избежать подобных проблем с конским каштаном в наши деревья? Вот несколько советов по выявлению проблем с конским каштаном и как избежать проблем.
Шахтер листьев конского каштана
Шахтер листьев конского каштана питается листьями дерева. Все требуется один зараженный саженец конского каштана, а затем проблемы с лошадью. майнер листьев каштана начинается. Ущерб от этих вредителей в основном эстетический и снижает их бодрость, но не вызывает реальных проблем со здоровьем дерево.Однако, поскольку внешний вид дерева составляет большую часть его ценности, мы хотят, чтобы они оставались жизнеспособными и свободными от вредителей.
Вы можете спросить, болен ли мой конский каштан? Не все Этому вредителю подвержены конские каштаны. Следите за листьями на вашем дереве пятна, которые сначала выглядят обесцвеченными, затем становятся коричневыми и рано закатываются но не падай с дерева. Сообщите об этом в свой местный окружной офис расширения. Также рассмотрите возможность добавления полезные насекомые в районе.
Бактериальный язвы кровотечения
Язвы, вызывающие бактериальное кровотечение, также вызывают проблемы у лошадей. каштаны.Ранее был вызван двумя фитофторами. патогены, повреждение, по-видимому, теперь вызвано бактериальным патогеном, Pseudomonas syringae pv aesculi , по данным Forest Research. Бактерии могут проникнуть через порезы или пятна после обрезки. где дерево имеет механические повреждения, например, от газонокосилки.
Кровоточащий язва вызывает проблемы как внутри, так и снаружи дерева и может привести к смерти. Сначала вы можете заметить кровоточащие поражения, жидкость необычного цвета, сочащуюся из пятен отмершей коры на стеблях или ветвях.Жидкость может быть черноватой, ржаво-красной или желтовато-коричневой. Он также может появиться в нижней части ствола.
Весной сок может быть прозрачным или мутным, высыхать жарким и сухим летом и возвращаться осенью. Поражения могут в конечном итоге окружить дерево или его ветви, из-за чего листья пожелтеют. Гниющие грибы могут поражать древесину, обнаженную повреждениями. В этой ситуации может помочь воздухопроницаемая пленка для деревьев, а также обрезка поврежденных веток намного ниже места заражения. Избегайте обрезки весной и осенью, когда бактерии наиболее активны.
лечить кровотечение язвы
Д-р Глинн К. Персиваль и мисс Келли Новисс
ВВЕДЕНИЕ
За последние несколько лет кровотечение, вызванное Pseudomonas, вызванное бактериальным патогеном Pseudomonas syringae pv aesculi (Pae), стало серьезной и широко распространенной проблемой конского каштана (Aesculus hippocastanum L.) в Великобритании. Симптомы инфекции включают характерное кровотечение из язвы, когда капли оранжево-красного, желто-коричневого или черного экссудата десны выделяются из пораженных участков коры на стволах или ветвях инфицированных деревьев (рис. 1).Со временем другие симптомы включают замедление роста побегов; мелкие листья, истончение кроны, отмирание прутьев и веток, растрескивание и раскалывание коры (рис. 2).
Поскольку наши знания в области биологии, эпидемиологии и лечения Pae ограничены, теперь требуется информация о стратегиях, которые можно использовать для подавления или идеального контроля этой проблемы. Однако ключевым моментом является то, что иногда было показано, что зараженные деревья выздоравливают и переживают атаку Паэ. Хотя основные причины этого неясны, это может быть связано с общим состоянием дерева.Это указывает на то, что конский каштан способен пережить инфекцию Pae. Таким образом, это указывает на то, что для подавления болезни можно рассмотреть два подхода: (1) использование обычных методов защиты растений, которые в значительной степени зависят от лечения патогена с помощью конкретных биологических или химических агентов; или (2) определение стратегий управления, специально разработанных для повышения жизнеспособности деревьев и, таким образом, предоставления дереву всех возможностей для восстановления после заражения Pae по собственному усмотрению.Поэтому рекомендуются следующие рекомендации по ведению Паэ.
РАЗЛОЖЕНИЕ ПОЧВЫ
Уплотнение почвы влияет на поровое пространство, выделяемое для воды и кислорода в структуре почвы, что, в свою очередь, создает среду, не оптимальную для роста корней. Уплотненная почва плохо впитывает воду и не пропускает воду. Меньше воздуха, чтобы обеспечить корни кислородом и унести углекислый газ, и меньше места для роста корней. Насыпная плотность меньше или равна 1.34 связан с затрудненным ростом корней. Если объемная плотность участка выше, чем это значение, следует произвести разуплотнение почвы с помощью лопаты для обработки почвы на минимальную глубину 15-25 см. В идеале вся область укоренения деревьев ниже линии капельного полога должна быть полностью заделана лопатками и разуплотнена. Если ресурсы ограничены, область ниже капельной линии купола должна быть разделена на восьмые части, а четыре из восьми секций разуплотнены. Кроме того, область 3 x диаметра на уровне груди должна быть полностью покрыта воздухозаборниками и разуплотнена.
УДОБРЕНИЕ
Оптимальное питание — важное средство повышения жизнеспособности деревьев. Деревья, страдающие от стресса, связанного с питательными веществами, обычно менее способны защитить себя от насекомых и болезней.
На основе результатов анализа почвы правильное содержание питательных веществ в удобрениях должно быть сопоставлено с любыми дефицитными элементами, чтобы гарантировать, что для устранения дефицита будут применяться только правильные питательные вещества в соответствующей концентрации. Однако выбор удобрения, используемого для восполнения дефицита питательных веществ, является ключевым моментом в управлении Pae.Настоятельно рекомендуется фосфит калия, поскольку было показано, что это удобрение стимулирует жизнеспособность деревьев и, в свою очередь, повышает устойчивость к широкому спектру грибковых и бактериальных заболеваний деревьев.
ДРЕНАЖ
Вода необходима для роста растений. Однако слишком мало или слишком много воды может привести к упадку и гибели растений. Когда в почве удерживается слишком много воды или ограничивается движение воды через нее, результатом может быть деоксигенация корней, заболевание корней и, в конечном итоге, гибель корней.На плохо осушаемых участках растения могут не погибнуть, а вместо этого проявить симптомы хронического упадка (хлороз листьев, дефолиация, краевое опаление, карликовая листва, отмирание кроны). Деревья и кустарники, у которых из-за избытка воды теряются корни, также более подвержены атакам и вторжению со стороны болезней и насекомых. Внутренний дренаж почвы на участке следует оценить с помощью теста на просачивание и, при необходимости, применить дренаж. Аналогичным образом, чтобы гарантировать, что условия дренажного участка остаются подходящими для здорового роста растений, следует использовать датчики влажности почвы для мониторинга состояния воды в почве.
МУЛЬЧ
Преимущества мульчи включают в себя минимизацию колебаний температуры почвы и влажности почвы, тем самым стимулируя рост корней, подавление сорняков, обогащение почвы питательными веществами, регулирование pH, стимулирование микробной активности почвы и улучшение аэрации. Кроме того, мульча может предотвратить повреждение косилкой и косилкой ствола дерева и действовать как буфер, предотвращая просачивание излишков антиобледенительных солей в почву вокруг корневой зоны. Также появляется все больше доказательств того, что мульча обладает потенциалом для подавления ряда почвенных болезней, таких как ризоктония, фузариоз, питий и фитофтора.Аллелохимические вещества в результате разложения мульчи могут обладать фунгицидными и бактериальными свойствами. Хотя влияние мульчи на язвы Pae неизвестно, широко распространенные положительные преимущества мульчи указывают на то, что их всегда следует рассматривать как часть стратегии управления для повышения жизнеспособности деревьев и, следовательно, как средство борьбы с инфекцией Pae.
КОНТРОЛЬ КОНСЕРВНОГО КАШТАНА (HCLM)
HCLM может вызвать серьезное разрушение листьев многих деревьев конского каштана.Исследования, проведенные в Университете Рединга, показали, что заражение HCLM пагубно сказывается на здоровье деревьев, и контроль HCLM в максимально возможной степени будет полезен для восстановления деревьев от Pae. Исследования потери энергии конским каштаном, зараженным HCLM в Великобритании, подсчитали, что потеря энергии всего дерева составляет от 37 до 41%. Аналогичным образом, в отдельном эксперименте, проведенном в Исследовательской лаборатории Бартлетт-Три и Университете Рединга, кровоточащие язвенные поражения были больше по размеру у саженцев, инокулированных Pae, где HCLM не контролировался, по сравнению с саженцами, где HCLM контролировался.Повреждение HCLM можно частично уменьшить, удалив опавшие листья осенью и зимой, а затем либо тщательно их компостируя, либо
жжение. Распыление дифлубензурона, регулятора роста насекомых, которое продается под торговой маркой Dimlin Flo, для коры и растительного покрова, может обеспечить контроль на 80-100%, если можно опрыскивать весь растительный покров. Admire — это инсектицид для внесения в почву, зарегистрированный для борьбы с вредными организмами, включая HCLM. Способ доставки Admire — через инъекцию почвы или орошение корней.
РЕЗЮМЕ: ПРОГРАММА УПРАВЛЕНИЯ ПО ПОДДЕРЖКЕ РАКА КРОВОТЕЧЕНИЯ PAE
Ключевым фактором в отношении управления Pae является понимание того, что иногда зараженные деревья могут выздоравливать и выжить.Поэтому стратегии управления должны быть нацелены на повышение жизнеспособности деревьев, то есть на лечение пациента, а не болезни.
Этого должно быть достигнуто:
1. Осмотр на наличие каких-либо внешних симптомов, которые могут вызвать стресс у деревьев, например, при строительстве нового здания, и при необходимости принять меры.
2. Обеспечение оптимального питания деревьев. Взять образцы почвы на предмет содержания питательных веществ и уровней pH на основе анализа питательных веществ в почве и удобрить подходящими питательными веществами для почвы.
3. Нанесите подходящий продукт для контроля HCLM.Атака HCLM может снизить энергетический бюджет конского каштана на 30-40%, что потенциально может повлиять на энергию, доступную для производства защитных метаболитов.
4. Нанесите органические вещества, например, деревянную мульчу, на глубину 5-10 см. В идеале, если возможно, мульчу следует вносить на расстоянии 1 м от капельной линии кроны.
5. Берегитесь чрезмерного и недостаточного полива. Используйте уровни влажности почвы, чтобы обеспечить оптимальное состояние воды в почве для роста деревьев.
6. Почва разуплотняется, если объемная плотность почвы меньше или равна 1.34 используя лопату для стимуляции роста корней.
| Рис. 1. Кровоточащие язвы и поражения | Рис. 2. Симптомы Паэ на деревьях |
http://www.bartlett.com/resources/Managing-Pseudomonas-Bleeding-Canker-of-Horse-Chestnut.pdf
КОНЕЧНЫЙ КАШТАНОВЫЙ РАК, ВЫЗВАННЫЙ PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. AESCULI В ЧЕХИИ
КОНЕЧНЫЙ КАШТАН КРОВОТЕЧЕНИЕ РАКА, ВЫЗВАННОГО PSEUDOMONAS SYRINGAE PV.AESCULI В ЧЕХИИ
| ||||||||||||
URL www.actahort.org Хостинг KU Leuven © ISHS
Выделение, характеристика и экспериментальная эволюция фага, инфицирующего возбудителя конского каштана, Pseudomonas syringae pv.aesculi
Джеймс, С. Л., Рэби, М., Нойман, Б. В., Персиваль, Г. и Джексон, Р. В. (2020) Выделение, характеристика и экспериментальная эволюция фага, инфицирующего возбудителя конского каштана, Pseudomonas syringae pv. aesculi. Текущая микробиология, 77 (8). С. 1438-1447. ISSN 0343-8651
Рекомендуется ссылаться на версию издателя, если вы собираетесь цитировать эту работу. См. Руководство по цитированию.
Для ссылки на этот элемент DOI: 10.1007 / s00284-020-01952-1
Резюме / Резюме
Язвенная болезнь конского каштана — бактериальное заболевание, вызываемое бактерией Pseudomonas syringae pv. aesculi, который, по оценкам, присутствует примерно в 50% конских каштанов в Великобритании. В настоящее время болезнь неизлечима, и удаление деревьев может быть обычным методом уменьшения инокулята и предотвращения распространения. Один из возможных методов борьбы может быть достигнут с использованием встречающихся в природе бактериофагов, инфекционных для возбудителя.Бактериофаги были изолированы от деревьев конского каштана с симптомами и бессимптомно в трех местах на юго-востоке Англии. С помощью RAPD-ПЦР и просвечивающей электронной микроскопии было обнаружено, что фаги принадлежат как к семействам Myoviridae, так и к семействам Podoviridae. Экспериментальная коэволюция была проведена для понимания динамики устойчивости бактерий и фаговой инфекции, а также для определения появления новых инфекционных генотипов фагов. Фаги демонстрировали разные паттерны коэволюции со своими бактериальными хозяевами во времени.Этот подход может быть использован для создания новых фагов для использования в коктейлях для биоконтроля в целях снижения потенциального возникновения бактериальной устойчивости.
Загрузки
Загрузки в месяц за последний год
| Спонсоры: | Совет по исследованиям окружающей среды | Спонсирующие организации, которые внесли средства на создание этого объекта. Пример: NERC Пример: Королевское химическое общество Список для выбора спонсоров может появиться при вводе имени спонсора полностью или в виде аббревиатуры. Выберите правильное соответствие, чтобы заполнить поле, или введите новую запись полностью. Для новых записей предпочтительно полное имя. |
|---|---|---|
| Проектов: | Использование экспериментальной эволюции для создания агентов фаговой терапии для нацеливания на возбудителя кровотечения из конского каштана, Pseudomonas syringae pv. aesculi При финансовой поддержке: Совет по исследованиям окружающей среды (NE / H018891 / 1 — 66 945 фунтов стерлингов) Руководитель проекта: Роберт Уилсон Джексон 1 октября 2010 г. — 30 сентября 2014 г. | Щелкните Добавить , чтобы выбрать проект (полученный при чтении) из списка автозаполнения. |
| Дата депонирования: | 28 апр 2020 13:55 | Дата депонирования элемента в CentAUR |
|---|---|---|
| Последнее изменение: | 09 июл 2021 20:49 | Дата последнего изменения элемента | 1
Глобальная база данных ЕОКЗР
На северо-западе Европы с начала 2000-х гг. В городских условиях, лесах и питомниках наблюдается рост числа увядающих и умирающих деревьев конского каштана ( Aesculus hippocastanum ).На пораженных деревьях видны трещины коры и кровоточащие язвы на стволе, дефолиация, общий упадок, в конечном итоге приводящий к гибели дерева через 2 или 3 года. Хотя сначала предполагалось присутствие видов Phytophthora , исследования показали, что это бактерия, Pseudomonas syringae pv . aesculi, был неизменно связан с заболеванием. Этот патовар Pseudomonas syringae первоначально наблюдался из Aesculus indica в Индии , , но не удалось найти никакой дополнительной информации о том, какой ущерб он может причинить Aesculus spp.деревья в Индии или других странах. Молекулярные исследования показали, что последовательности гена гиразы B получены из P. syringae pv . aesculi , выделенные в Индии (на листве A. indica ) и от штамма P. syringae , выделенного в Соединенном Королевстве (на A. indica , показывающем симптомы пятнистости листьев в Суррее в 2005 г.), были идентичны. Исследования прививок, проведенные в Соединенном Королевстве, подтвердили патогенность P. syringae pv. aesculi — A. hippocastanum . 5-летние саженцев A. hippocastanum инокулировали P. syringae pv . aesculi и развились некротические поражения коры и кровотечение; ту же бактерию можно затем повторно выделить из инокулированных растений.
Учитывая серьезность болезни и ее текущее распространение в Европе, Группа ЕОКЗР по фитосанитарным правилам рекомендовала добавить Pseudomonas syringae pv. aesculi в Список оповещений ЕОКЗР.
Pseudomonas syringae pv . aesculi (новая болезнь конского каштана)
Почему: С начала 2000-х годов в некоторых европейских странах все чаще наблюдаются общие спады и кровоточащие язвы конского каштана ( Aesculus hippocastanum ). Исследования показали, что бактерия, Pseudomonas syringae pv .aesculi, была неизменно связана с этим заболеванием, и теперь считается, что эта бактерия является основной причиной этого нового заболевания. Учитывая серьезность болезни и ее текущее распространение в Европе, Группа ЕОКЗР по фитосанитарным правилам рекомендовала добавить Pseudomonas syringae pv. aesculi в Список оповещений ЕОКЗР.
Где:
Регион ЕОКЗР: Бельгия, Франция (Нор-Па-де-Кале), Германия, Нидерланды и Великобритания (Англия, Шотландия, Уэльс).
Азия : Индия. Этот патовар P. syringae был впервые обнаружен у Aesculus indica в Индии, но не удалось найти дополнительной информации о степени или серьезности заболевания, которое он может вызвать в Индии или других странах Азии.
Во Франции первые больные деревья были обнаружены в 2001 году в городе Рубе, а затем в других местах в регионе Нор-Па-де-Кале (Вильнёв-д’Аск, Лилль, Туркуэн, Геллемм, Монс-ан- Барёль, Лескен, Нордпин).В то же время аналогичные симптомы были зарегистрированы и из Бельгии. В Нидерландах обследования, проведенные в 2007/2008 годах, показали, что 30% всех конских каштанов в большей или меньшей степени поражены этой болезнью. Первоначально все инфекции были локализованы в западной части Нидерландов, но теперь они наблюдаются по всей стране. В Соединенном Королевстве: предыдущие эпизоды кровоточащих язв конского каштана в 1970-х годах приписывались Phytophthora sp.но эти кровоточащие язвы считались необычными и наблюдались только на юге Англии. Однако с 2003 года в Соединенном Королевстве наблюдается всплеск заболеваемости. Из 4 случаев, зарегистрированных в 2001 году, 60 были зарегистрированы в 2003 году, 90 — в 2004 году, 75 — в 2005 году и более 110 были зарегистрированы в 2006 году, а также в таких северных районах, как Ланкашир (северо-запад Англии), Глазго и Файф ( Шотландия). В Германии присутствие P. syringae pv . aesculi был подтвержден в 2008 г. на одном дереве в Гамбурге, но болезнь наблюдалась на других деревьях (без дополнительных сведений об их местонахождении в Германии).
На каких растениях: Aesculus spp. (конские каштаны). A. hippocastanum (как белые, так и красные сорта) является наиболее пораженным видом. В частности, A. hippocastanum cv. ‘Baumanii’ оказался чрезвычайно восприимчивым к заболеванию. В настоящее время проводятся исследования восприимчивости других видов (например, A. x mutabilis, A. flava, A. parviflora и A. pavia ) с дополнительной целью поиска возможных источников устойчивости.Могут быть поражены деревья любого возраста, но более молодые деревья (10-30 лет) могут погибнуть от болезни через 3-5 лет.
Повреждение: Симптомы обычно начинаются с кровоточащих поражений: разбросанные капли ржаво-красной, желто-коричневой или почти черной липкой жидкой слизи на участках отмирающей коры на стеблях, ветвях или стволах. Эти поражения можно наблюдать у основания дерева или на высоте около 1 метра на стволе (затем распространяются вверх). Кровотечение из инфицированных тканей может быть довольно обильным, и в сухих условиях оно может оставлять темную хрупкую корку возле точки выхода.Под корой наблюдаются крапчатые и оранжево-коричневые пятна. С годами участки мертвой флоэмы и камбия под кровоточащими участками могут сливаться и расширяться, пока не опоясывают весь ствол или ветвь. Затем становятся видимыми симптомы на кроне дерева, обычно состоящие из пожелтения листьев, преждевременного опадания листьев и, в конечном итоге, гибели дерева. Например, в Соединенном Королевстве на основе обследования, проведенного в 2007 году, было подсчитано, что от 35 000 до 50 000 деревьев были поражены и, вероятно, несколько тысяч уже были вырублены в результате болезни.
Картины симптомов можно посмотреть в Интернете:
http://www.forestry.gov.uk/fr/INFD-6L4GBT
http://www.kastanjeziekte.wur.nl/uk/index_uk.htm
Передача: На данный момент эпидемиология болезни остается неизвестной. P. syringae можно выделить на поверхности листьев и ветвей конского каштана, а также на цветках и различных частях плодов. Бактерии также были обнаружены в дождевой воде в районе больных деревьев.Однако необходимы дополнительные исследования, чтобы определить возможную роль воды, насекомых или даже деятельности человека (например, обрезки) в передаче болезней.
Путь: Растения для посадки видов Aesculus , части растений (например, листва, древесина, семена)? почва?
Возможные риски: Конский каштан ( Aesculus spp.) Широко посажены по всему региону ЕОКЗР, в основном в качестве благоустроенных деревьев в парках и садах или вдоль дорог, но их также можно найти в лесных массивах.Поскольку эпидемиология болезни в значительной степени неизвестна, можно рекомендовать несколько мер контроля. Однако, вероятно, можно будет принять профилактические меры для предотвращения распространения болезни (например, как можно больше избегать обрезки, оборудование для обрезки следует дезинфицировать, больной растительный материал следует перевозить в закрытых контейнерах, сжигать или тщательно компостировать). Как правило, отсутствуют данные о географическом распространении, биологии и эпидемиологии болезни. Учитывая значительную гибель деревьев, которая уже наблюдалась в северо-западной Европе, желательно предотвратить дальнейшее распространение P.syringae pv . aesculi , поскольку этот патоген представляет серьезную угрозу для благоустроенных деревьев, лесных массивов и питомников.
EPPO RS 2009/117 | |
Дата рассмотрения панели: — | Дата поступления 2009-06 |
Bardoux S, Rousseau P (2007) Le dépérissement bactérien du marronnier. Phytoma — La Défense des Végétaux no.605, 22-23.
Дургапал Дж. К., Сингх Б. (1980) Таксономия псевдомонад, патогенных конскому каштану, дикому инжиру и дикой вишне в Индии. Индийская фитопатология 33 , 533-535 (абст.).
Schmidt O, Dujesiefken D, Stobbe H, Moreth U, Kehr R, Schroder T (2008) Pseudomonas syringae pv. aesculi , связанный с язвой из-за кровотечения из конского каштана в Германии. Лесопатология 38 (2), 124-128.
Webber JF, Parkinson NM, Rose J, Stanford H, Cook RTA, Elphinstone JG (2008) Выделение и идентификация Pseudomonas syringae pv. aesculi вызывает кровотечение из конского каштана в Великобритании. Патология растений 57 (2), стр. 368.
ИНТЕРНЕТ (последнее обращение 06.06.2009)
.